王振苗 董麗榮 賈 評(píng) 田 慧

(河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院，張家口，075100)

苦苣菜又名苦菜，在我國(guó)廣泛分布?？嘬牟藢僦参锏闹饕钚猿煞质潜栋胼祁惡忘S酮類，此外還有香豆素類、甘油酸酯苷類、木脂素類等[1]。該屬藥用植物及其提取物具有降血糖、降膽固醇、利尿、降壓、抗凝血、保肝、抗炎、抗菌、抗腫瘤等多方面的藥理作用，同時(shí)含有維生素C、維生素B1、B2、胡蘿卜素、煙酸等多種維生素，以及銅、鎂、鐵、鋅等多種微量元素，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，開發(fā)前景十分廣闊[2]。特別是近年來，許多實(shí)驗(yàn)研究表明該屬植物具有抗菌、抗炎作用，可明顯抑制動(dòng)物耳腫、足腫，并能抑制腹腔毛細(xì)血管通透性增加。但具體機(jī)制研究報(bào)道較少，且涉及抗氧化、減少NO生成、抑制凋亡等多個(gè)方面，缺乏梳理和闡明，本研究探析苦苣菜水提物對(duì)小鼠的鎮(zhèn)咳、祛痰和抗炎作用的觀察，效果滿意，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 昆明種小鼠，體重18～22 g，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)(SCXK(滬)2002-0010)飼養(yǎng)條件:小鼠分開飼養(yǎng)，籠內(nèi)墊干燥、清潔刨花，溫度：18～22 ℃、相對(duì)濕度：50～60%、噪聲：60 dB以下、換氣：8～20次/h、照明：10～14 h，飼料需富含蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分。

1.1.2 藥物 二甲苯(天津市巴斯夫化工有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字20060812)，碳酸氫鈉(天津市四通化工廠，批號(hào):20010209)；苯酚紅(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20081006)；地塞米松磷酸鈉注射液(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，批號(hào)：09118307)；氯化銨(天津市巴斯夫化工有限公司，批號(hào)：20040824)。

1.1.3 儀器 UV-2550紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，電子天平(上海恒華科學(xué)儀器有限公司)，分析天平(奧豪斯上海有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 苦苣菜水提物的制備 苦苣菜采自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)土默特左旗田間，后經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)教研室鑒定?？嘬牟巳荩幐?，剪碎，稱取原生藥130 g，加適量水浸泡30 min，按照1∶10固液比加水，煎煮60 min，收集濾液I；濾渣加適量水煎煮45 min，得濾液II。合并I、II，經(jīng)減壓濃縮，得1.3 g/mL濃縮液(濾液Ⅲ)100 mL，冷卻，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 分組與模型制備 二甲苯致耳腫脹模型：末次給藥30 min后，于小鼠右后跖皮下注射1%角叉菜膠30 μL致炎，5 h后斷頭處死小鼠，取血，并從跟骨水平(踝關(guān)節(jié)中線以下)對(duì)稱剪下鼠足，稱重，以左、右足重量差作為小鼠足腫脹度。根據(jù)隨機(jī)對(duì)照法分為正?？瞻讓?duì)照組、模型組、苦苣菜水提物劑量I組、苦苣菜水提物劑量II組、苦苣菜水提物劑量III組，每組均為10只，

1.2.3 給藥方法 參照“常用動(dòng)物與人體表面積比值表”，通過換算，確定本次實(shí)驗(yàn)采取灌胃給藥途徑，小鼠的苦苣菜水提物各組給藥濃度分別為0.26 g/10 g、0.13 g/10 g、0.065 g/10 g。每次給藥前，倍比稀釋1.3 g/mL濃縮液，得各劑量組溶液。將小鼠隨機(jī)分成10組(n=10)，5組進(jìn)行耳腫實(shí)驗(yàn)，其余5組進(jìn)行足腫實(shí)驗(yàn)。耳腫實(shí)驗(yàn)中，分別為耳腫模型組、地塞米松2 mg/kg陽性藥物組、苦苣菜水提物0.26 g/10 g劑量組、苦苣菜水提物0.13 g/10 g劑量組、苦苣菜水提物0.065 g/10 g劑量組。各組均采用灌胃給藥，給藥前夜禁食不禁水，給藥容量按體重計(jì)算0.2 mL/10 g，連續(xù)給藥5 d。苦苣菜水提物各劑量組分別給予不同濃度的苦苣菜水提物，陽性對(duì)照組給予地塞米松磷酸鈉注射液2 mg/kg，模型組則分別予以等量生理鹽水。

1.2.4 觀察指標(biāo)與方法 1)炎性反應(yīng)相關(guān)因子和炎性介質(zhì)的含量測(cè)定：血清：室溫血液自然凝固10～20 min，離心20 min(3 000 r/min)，收集上清，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩１４孢^程中如出現(xiàn)沉淀，可再次離心。炎性組織液：整個(gè)致炎小鼠足爪稱重后，剪碎，放入3 mL 0.9%的生理鹽水中，充分浸泡。離心20 min(3 000 r/min，-4 ℃)，制得炎性組織液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?yīng)用ELISA試劑盒，分別進(jìn)行環(huán)加氧酶2(COX-2)、P38活化蛋白酶絲裂原(p38MAPK)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)含量的測(cè)定。

2)鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)-氨水引咳法：取小鼠18～22 g，除去3 min內(nèi)未出現(xiàn)咳嗽反應(yīng)的小鼠，2 d后取50只合格小鼠，根據(jù)體重隨機(jī)分為5組，每組小鼠分布予以0.2 mL/10 g灌胃，空白溶液為生理鹽水、模型組、苦苣菜水提液，連續(xù)1周；最后一次給藥前禁食不禁水12 h，在最后一次給藥1 h后，將氨水棉球放置在倒置的圓口燒杯下觀察每組小鼠的咳嗽潛伏期和2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)(縮胸，腹肌收縮，嘴張大為標(biāo)準(zhǔn))。

3)祛痰實(shí)驗(yàn)-氣管酚紅法：建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱量0.1 g酚紅，予以5%碳酸氫鈉溶液配制成1000 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液(母液)，在100 mL容器瓶?jī)?nèi)吸取2.00、1.75、1.25、1.00、0.75、0.50、0.25 mL母液，應(yīng)用三蒸水稀釋至刻度；在546 nm處檢測(cè)光密度值(OD)分布為0.331、0.295、0.248、0.210、0.169、0.127、0.082，以O(shè)D值線性回歸酚紅溶液濃度，得回歸方程；實(shí)驗(yàn)方法：取50只小鼠(18～22 g)，根據(jù)體重隨機(jī)分為5組，每組分別灌胃苦苣菜水提液、氯化銨溶液、空白溶液(生理鹽水)0.2 mL/10 g，連續(xù)1周，最后一次給藥前禁食不禁水12 h，最后一次給藥1 h后，腹腔注射0.1 mL/10 g 0.5%酚紅，酚紅注射1 h后，斷頭處死小鼠，氣管周圍組織進(jìn)行剝離，將甲狀軟骨至氣管分支處的一段氣管剪下，置于試管內(nèi)(含有生理鹽水2 mL)，再加入0.1 mL5%碳酸氫鈉溶液，離心半小時(shí)，分離上清液，紫外可見光光度計(jì)在546 nm處檢測(cè)OD值。

4)抗炎實(shí)驗(yàn)：二甲苯致耳腫脹法：取小鼠50只(18～22 g)，根據(jù)體重隨機(jī)分為五組，每組小鼠分別灌胃苦苣菜水提液、地塞米松溶液、空白溶液(0.2 mL/10 g)，連續(xù)1周，最后一次給藥前禁食不禁水12 h，最后一次給藥0.5 h后，在小鼠右耳內(nèi)外兩側(cè)均勻涂抹二甲苯，0.02 mL/只；致炎1.5 h后，斷頭處死小鼠，將小鼠左右耳剪下，在左右耳同一部位應(yīng)用打孔器打下等大的圓形耳片，稱重，腫脹度為右耳重與左耳重的差值；腫脹抑制率=(對(duì)照組腫脹度-給藥組腫脹度)/對(duì)照組腫脹度×100%。比較5組對(duì)小鼠的鎮(zhèn)咳作用的影響(咳嗽次數(shù)、潛伏期)；比較5組對(duì)小鼠氣管的酚紅排泌量、苦苣菜水提物抗二甲苯致小鼠耳腫脹影響；比較不同劑量的苦苣菜水提物環(huán)加氧酶2(COX-2)、P38活化蛋白酶絲裂原(p38MAPK)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)含量的變化。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠的鎮(zhèn)咳作用的影響 苦苣菜水提物I組、苦苣菜水提物II組、苦苣菜水提物III組、模型組與空白對(duì)照組比較其潛伏期、咳嗽次數(shù)均有降低，但苦苣菜水提物III組的咳嗽潛伏期、咳嗽次數(shù)顯與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 對(duì)小鼠的鎮(zhèn)咳作用的影響

注:T1/P1為模型組與空白組比較；T2/P2為苦苣菜水提物I組與空白組比較；T3/P3為苦苣菜水提物II組與空白組比較；T4/P4為苦苣菜水提物III組與空白組比較

表2 對(duì)小鼠氣管的酚紅排泌量、苦苣菜水提物抗二甲苯致小鼠耳腫脹影響

注:T1/P1為模型組與空白組比較；T2/P2為苦苣菜水提物I組與空白組比較；T3/P3為苦苣菜水提物II組與空白組比較；T4/P4為苦苣菜水提物III組與空白組比較

2.2 5組對(duì)小鼠氣管的酚紅排泌量、苦苣菜水提物抗二甲苯致小鼠耳腫脹影響 苦苣菜水提物I組、苦苣菜水提物II組、苦苣菜水提物III組、模型組與空白對(duì)照組比較，其酚紅排泌量均高于空白對(duì)照組，但苦苣菜水提物III組的酚紅排泌量與空白對(duì)照組比較更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；苦苣菜水提物I組、苦苣菜水提物II組、苦苣菜水提物III組與空白對(duì)照組比較，其抗二甲苯致小鼠耳腫脹均有降低，但苦苣菜水提物III組更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表3 不同劑量的苦苣菜水提物COX-2、p38MARK、TNF-α、IL-6含量的評(píng)估比較

注:T1/P1為苦苣菜水提物I組與空白組比較；T2/P2為苦苣菜水提物II組與空白組比較；T3/P3為苦苣菜水提物III組與空白組比較

2.3 不同劑量的苦苣菜水提物環(huán)加氧酶2(COX-2)、P38活化蛋白酶絲裂原(p38MARK)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)含量的評(píng)估比較 不同劑量的苦苣菜水提物與空白對(duì)照組比較COX-2、P38MARK、TNF-α指標(biāo)均有降低，但苦苣菜水提物III組的臨床指標(biāo)顯著低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

3 討論

炎性反應(yīng)是機(jī)體在致炎因子作用下所發(fā)生的以防御反應(yīng)為主的病理反應(yīng)或病理過程。炎性介質(zhì)是一種生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞或體液中產(chǎn)生[3-6]。這些物質(zhì)通過各種途徑作用于血管，引起血管擴(kuò)張、通透性增加和引起滲出，在炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。研究藥物的抗炎作用，受限必須復(fù)制動(dòng)物模型的炎性反應(yīng)，一般先選用以血管通透性為主要改變的急性炎性反應(yīng)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。二甲苯致耳腫脹模型是國(guó)內(nèi)比較常用的抗炎機(jī)制模型。角叉菜膠致小鼠足腫脹模型是一個(gè)急性非感染性炎性反應(yīng)模型，當(dāng)給小鼠足跖內(nèi)注射角叉菜膠時(shí)能發(fā)生與人體相似的急性炎性反應(yīng)，如局部毛細(xì)血管擴(kuò)張、血管通透性增高、滲出、水腫等，骨該模型在新藥評(píng)價(jià)中應(yīng)用十分廣泛。該模型具有差異性小，高度重現(xiàn)性等特點(diǎn)[7-8]。

本研究探析苦苣菜水提物對(duì)小鼠的鎮(zhèn)咳、祛痰和抗炎作用觀察，結(jié)果顯示：苦苣菜水提物I組、苦苣菜水提物II組、苦苣菜水提物III組、模型組與空白對(duì)照組比較其潛伏期、咳嗽次數(shù)均有降低，但苦苣菜水提物III組的咳嗽潛伏期、咳嗽次數(shù)顯與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；苦苣菜水提物I組、苦苣菜水提物II組、苦苣菜水提物III組、模型組與空白對(duì)照組比較，其酚紅排泌量均高于空白對(duì)照組，但苦苣菜水提物III組的酚紅排泌量與空白對(duì)照組比較更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；苦苣菜水提物I組、苦苣菜水提物II組、苦苣菜水提物III組與空白對(duì)照組比較，其抗二甲苯致小鼠耳腫脹均有降低，但苦苣菜水提物III組更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同劑量的苦苣菜水提物與空白對(duì)照組比較COX-2、P38MAPK、TNF-α、IL-6指標(biāo)均有降低，但苦苣菜水提物III組的臨床指標(biāo)顯著低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與康文藝等[9]的研究結(jié)果大體一致，苦苣菜提取物具有顯著的抑制作用，且該提取物能夠顯著減少小鼠的染色皮膚面積和皮膚染料量，當(dāng)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加時(shí)，該提取物也具有一定的抑制作用，隨著提取物含量的變化，小鼠足炎性反應(yīng)某些衡量參數(shù)也具有顯著改變；在抗凝血方面，苦苣菜提取物的效果十分明顯；本研究結(jié)果顯示苦苣菜水提物可顯著延長(zhǎng)氨水誘導(dǎo)的小鼠咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，提示該藥具有顯著的鎮(zhèn)咳功能[10-13]；同時(shí)可促進(jìn)小鼠氣管排出酚紅量，增加小鼠氣管痰液分泌量，且可顯著降低COX-2、P38MAPK、TNF-α、IL-6水平，說明苦苣菜提取物具有顯著的抗炎作用。綜上所述，苦苣菜水提物可不同程度的抑制炎性腫脹，其對(duì)急性炎性反應(yīng)的保護(hù)作用可能與下調(diào)機(jī)體的COX-2、P38MAPK、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子和炎性反應(yīng)介質(zhì)的釋放，以及調(diào)節(jié)機(jī)體有關(guān)炎性反應(yīng)發(fā)生通路有關(guān)。