邵 瓊 張 瑩 王艷梅 嚴敢意

(1 湖北省鄂州市中心醫(yī)院中草藥房,鄂州,436000; 2 湖北省鄂州市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科,鄂州,436000)

小青龍顆粒是由出自《傷寒論》的經(jīng)典方小青龍湯制成顆粒劑而來,近年來顆粒劑逐漸在各大醫(yī)院流行,以滿足想服用中藥而沒時間煎藥的患者。小青龍顆粒的藥物組成和原方小青龍湯一樣,由麻黃、芍藥、桂枝、炙甘草、細辛、半夏、生姜和五味子組成,主要用于治療太陽傷寒兼里停水飲證,原文中記載“傷寒表不解,心下有水氣,干嘔,發(fā)熱而咳,或渴,或利,或噎,或小便不利、少腹?jié)M,或喘者,小青龍湯主之”,而現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)小青龍湯/小青龍顆粒對具有改善肺通氣功能,緩解氣道平滑肌的痙攣而降低其高反應作用,對支氣管哮喘急性發(fā)作期[1-2]、急慢性支氣管炎發(fā)作期[3-5]和慢性阻塞性肺疾病發(fā)作期[6]等有顯著療效。小青龍湯的組方配伍特點可以看出,麻黃、桂枝均為性溫之藥,溫能走表,溫能散寒,除外感之風寒;干姜、半夏、五味子也均屬于性溫之藥,然其溫能走里,化里之寒邪,其中干姜溫中回陽以固本,溫肺化飲以祛肺寒之邪;半夏性溫而化寒痰,使邪出有道而不滯于內(nèi);細辛性溫而入表里;全方以溫藥為主配以炙甘草調和諸藥[7-8]。而小青龍顆粒經(jīng)過制備后是否具有良好的中藥質量水平,其質量水平是否能通過小青龍顆粒的組方特點進行預測,基于上述疑問展開本課題研究,在中藥單味藥物及復方研究中高效液相色譜是目前比較公認的研究手段,本研究結果顯示,可通過高效液相色譜檢測方法對單位藥物指紋圖譜的分析預測小青龍顆粒制劑質量水平的組方特點?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 購買于Agilent科技有限公司的高效液相色譜儀(Agilent 100,應用ChenmStation工作站),購買于北京賽多利斯天平有限公司的0.1 mg分析天平(型號:Sarturius BS110S)。

1.2 試劑 甲醇(色譜純)、無水乙醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、磷酸(色譜純)和去離子水均購于天津市康科德技術有限公司。

1.3 分析樣品 22個不同批次小青龍顆粒(四川泰樂制藥有限公司,國藥準字Z10983085);麻黃、芍藥、桂枝、甘草均本院藥房提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 進樣量為2 μL,研究中選用250 mm×4.6 mm的C18色譜柱(型號:Arcus EP),柱溫為35 ℃,而流動相A為0.1%磷酸水+0.02%庚烷磺酸鈉;流動相B為82乙腈:10無水乙醇:8(水+0.24%磷酸),檢測波長為220 nm。

表1 梯度洗脫表(流速1.0 mL/min)

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1小 青龍顆粒供試品溶液制備 小青龍顆粒適量加入25 mL甲醇,采用回流提取的方式提取小青龍顆粒1 h,取第1次過濾液,殘渣中繼續(xù)加入等量甲醇提取30 min,取第2次過濾液,混合兩次過濾液并以甲醇定容50 mL,制取小青龍顆粒供試品溶液[9-10]。

2.2.2 4種組方藥材供試品溶液制備

2.2.2.1 組方量制備法 根據(jù)小青龍顆粒組方量(即配方中單味藥材的含量)配制法取麻黃(約1.5 g)、芍藥(1.5 g)、桂枝(1.5 g)、炙甘草(1.5 g)機械粉碎后,過篩于燒瓶中回流提取,同1.2.1的方法經(jīng)兩次過濾混合定容后,獲得組方量藥材供試品溶液。

2.2.2.2 單位質量制備法 單位質量即1 g,麻黃、芍藥、桂枝和炙甘草均分別精密稱取1 g,同2.2.2.1方法,機械粉碎和回流提取,獲得單位質量藥材供試品溶液。

2.3 專屬性試驗 通過專屬性試驗檢測小青龍顆粒各味藥物的專屬性,相互間是否存在干擾因素,結果顯示在相對保留時間內(nèi)各個峰之間不存在雜質峰,具有良好的專屬性。

2.4 中間精密度試驗 精密稱取同一小青龍顆粒供試品溶液,連續(xù)進樣6次,結果顯示共有峰相對保留時間RSD為0.08%,表明高效液相色譜儀具有良好的精密度。

2.5 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 將小青龍顆粒供試品溶液室溫放置0、2、4、12、24 h分別常規(guī)進樣測定HPLC色譜圖,結果顯示共有峰相對保留時間RSD為0.4%,表明小青龍顆粒供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.6 重復性試驗 以同一批小青龍顆粒,根據(jù)1.2.1配制6份小青龍顆粒供試品溶液,常規(guī)進樣測定HPLC色譜圖,結果顯示共有峰相對保留時間RSD為0.3%,表明高效液相色譜儀具有良好的重復性。

2.7 回收率試驗 精密稱取6份已知含量的同一批小青龍顆粒樣品各約6 g,分別精密加入10 mL混合對照品甲醇溶液,采用加樣回收法測定,計算結果顯示平均回收率的范圍是96.52%～104.73%,RSD的范圍是為0.67%～2.14%,表明高效液相色譜方法具有良好的準確度。

2.8 樣品測定結果

2.8.1 小青龍顆粒指紋圖譜的建立 根據(jù)1.3色譜條件檢測22批小青龍顆粒供試品溶液,檢測波長為220 nm,以15號峰甘草苷作為參照峰,共有40個共有峰的出現(xiàn)率均達到100%。根據(jù)系統(tǒng)指紋定量評價法[11-12],以宏定性相似度(Sm)、宏定量相似度(Pm)和指紋均化性變動誤差控制系數(shù)α三者相結合來評價中藥質量,22批小青龍顆粒供試品溶液經(jīng)系統(tǒng)指紋定量法鑒定,結果發(fā)現(xiàn)其中S13、S14、S19和S21等4個批次的小青龍顆粒質量相對較次;因此由S1-S12和S15-S18及S20、S22共18批小青龍顆粒供試品溶液重新用“中藥色譜指紋圖譜定量相似度數(shù)字化評價體統(tǒng)3.0”分析生成對照指紋圖譜,記作RFP。具體詳細見圖1和表2、表3。

圖1 22批小青龍顆粒指紋圖譜(波長220 nm)

2.8.2 組方色譜 根據(jù)1.2.2.1配制的組方量藥材供試品溶液進行高效液相色譜檢測,檢測波長220 m,將檢測所得的指紋圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜定量相似度數(shù)字化評價體統(tǒng)3.0”分析軟件中,設置0.1 min為時間漂移窗,根據(jù)全相加模式,將輸入某一范圍的時間域值,采用全相累加的方式將各單味藥色譜法累加,獲得組方指紋圖譜對應的峰,從而形成組方指紋圖譜,記作CSF1;根據(jù)最大化模式,將將輸入某一范圍的時間域值,將各單味藥色譜峰取最大峰作為組方指紋圖譜,記作CSF2。組方藥物燒瓶化學混合記作CMF,組方藥物直接物理混合記作PMF。具體詳細見圖2。

2.8.3 單位質量藥物色譜 根據(jù)1.2.2.2配制的單位質量藥材供試品溶液進行高效液相色譜檢測,檢測波長220 m,將檢測所得的指紋圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜定量相似度數(shù)字化評價體統(tǒng)3.0”分析軟件中,設置0.1 min為時間漂移窗,根據(jù)全相加模式,將輸入某一范圍的時間域值,采用全相累加的方式將各單味藥色譜法累加,獲得組方指紋圖譜對應的峰,從而形成組方指紋圖譜,記作CSF3;根據(jù)最大化模式,將將輸入某一范圍的時間域值,將各單味藥色譜峰取最大峰作為組方指紋圖譜,記作CSF4。具體詳細見圖2。

圖2 4種組方融合預測模式的指紋圖譜

2.8.4 組方模式預測小青龍顆粒質量結果 從表4可得,在組方模式預測小青龍顆粒質量結果中可以看出,組方色譜中組方全相加模式比組方最大化模式質量較低;單位質量藥物色譜中全相加模式比最大化模式質量等級低;而比較平均值1和平均值3發(fā)現(xiàn)組方色譜預測能力和單位質量藥物色譜的預測能力相當,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),進而從CMF和PMF的平均值2與RFP比較發(fā)現(xiàn),2組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),綜合研究結果顯示,可通過高效液相色譜檢測方法對單位藥物指紋圖譜的分析預測小青龍顆粒制劑質量水平的組方特點。團隊在此次小青龍顆粒組方特點的研究中未對半夏、生姜、細辛和五味子進行分析,主要由于在此色譜條件及檢測波長下未檢測出這4味藥物的特征峰,因此未對這4味藥物進行展開研究。

表2 22批小青龍顆粒系統(tǒng)指紋定量法評價質量結果

表3 22批小青龍顆粒系統(tǒng)指紋定量法評價質量結果

表4 組方模式預測小青龍顆粒質量結果

3 討論

3.1 麻黃-桂枝組方 麻黃與桂枝組方的作用會隨著組方的比例不同而不同,如《傷寒論》中麻黃湯,麻黃用藥比例比桂枝大,其作用即以發(fā)汗解表為主;而在桂枝去芍藥加麻黃細辛附子湯中,麻黃用藥比例比桂枝小,即呈現(xiàn)溫胃化飲之效;而在本研究中的小青龍湯組方中,麻黃與桂枝用藥比例相同,表里同治,即解表以治太陽傷寒證,又溫里以化寒飲郁肺證。高效液相色譜研究表明[13-14],在小青龍湯研究中,取單味桂枝水煎液、麻黃-桂枝多比例組方水煎液以及小青龍湯水煎液的供試品溶液計算香豆素、桂皮醇和桂皮醛的含量,研究結果發(fā)現(xiàn)隨著桂枝的比例增加,麻黃桂枝多比例組方水煎液中的5種麻黃生物堿的含量也隨之增加,而在桂枝單煎液中,5種麻黃生物堿的含量、香豆素、桂皮醇和桂皮醛的含量均出現(xiàn)不同程度的降低,此研究與《傷寒雜病論》中麻黃與桂枝的比例不同、作用不同這一理論遙相呼應。

3.2 麻黃-甘草組方 麻黃-甘草組方在《傷寒論》及《金匱要略》各經(jīng)典方劑中出現(xiàn)的頻次最多,本研究中的小青龍湯僅是其中一個出現(xiàn)麻黃-甘草組方的經(jīng)典方。麻黃-甘草組方,以水煎法制備麻黃甘草組方供試品溶液的HPLC研究中發(fā)現(xiàn),隨著甘草配比量的增加5種麻黃類生物堿的含量出現(xiàn)不同程度地降低,研究中發(fā)現(xiàn)中當4倍麻黃:1倍甘草時,5種麻黃類生物堿的含量含量最高;當2倍麻黃:1倍甘草時,5種麻黃類生物堿的含量含量適中;當1倍麻黃:1倍甘草時,5種麻黃類生物堿的含量最低;這一研究結果與“甘草調和諸藥”的藥理相吻合。此時當我們反觀麻黃-甘草組方后甘草苷、甘草酸的含量隨著配伍比例的改變情況,發(fā)現(xiàn)麻黃甘草水煎液中當麻黃配伍的比例逐漸減少時,甘草中的甘草苷、甘草酸的含量也逐漸降低。而本研究中的小青龍湯原方是1倍麻黃:1倍甘草,體現(xiàn)其解表而不傷氣的組方特點。

3.3 白芍-桂枝組方 《傷寒論》中桂枝、白芍組方多有調和營衛(wèi)、溫陽止汗之功。在指紋圖譜研究中當桂枝、白芍組方的配比不同時指紋圖譜上出現(xiàn)的特征峰也會不同。白芍-桂枝組方主要的化學成分包括沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、肉桂酸、香豆素等隨著比例的不同而出現(xiàn)不同的峰高。研究發(fā)現(xiàn)[15]小青龍湯芍藥-桂枝組方配比為1∶1時,肉桂酸和芍藥苷在指紋圖譜中的特征峰高比為7。

3.4 白芍-甘草組方 白芍-甘草組方有一個著名的緩急止痛代表方劑,即芍藥甘草湯,方中白芍與炙甘草配伍比例為1∶1,HPLC指紋圖譜研究芍藥甘草湯發(fā)現(xiàn),白芍中的芍藥苷和苯甲酰芍藥苷起到藥效作用,而甘草中的甘草苷和甘草酸含量最高[16]。小青龍湯中白芍與炙甘草組方配比同芍藥甘草湯,為1∶1,有研究表明0.6∶1、1∶1、3∶1等3個不同配比的白芍-炙甘草組方,以3∶1配比中的芍藥苷、甘草苷和甘草酸的溶出率最高,其次為1:1配比的白芍-炙甘草組方,0.6∶1配比的白芍-炙甘草組方最低[17]。