李永芳，李艾帆，張玉超，姜曉蕊，崔傳舉，袁樹華，賀穎，鄭紅

（1.河南大學附屬鄭州市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內科，河南 鄭州 450000；2.河南大學附屬鄭州市第一人民醫(yī)院 優(yōu)生遺傳室，河南 鄭州 450000；3.鄭州大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳與細胞生物學系，河南 鄭州 450001）

近年來，很多研究表明，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）參與了急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke, AIS）過程中的炎癥反應及繼發(fā)腦損傷[1]。MMPs是一族在細胞外基質降解及再塑中發(fā)揮重要作用的鋅離子依賴的中性蛋白酶家族，研究表明其在動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮著重要作用[2-3]，而動脈粥樣硬化又在AIS發(fā)病程過程中扮演重要角色[4]，因此筆者推測MMPs可能通過參與動脈粥樣硬化過程從而在AIS發(fā)揮作用。MMP-3是MMPs家族中重要成員，可激活多種MMPs的生物活性[5]，筆者推測MMP-3啟動子-1612（5A/6A）基因多態(tài)性可能是AIS的易感因素。本研究旨在通過基因測序技術，探討MMP-3啟動子基因多態(tài)性與AIS的關系并探討其機制，從而為AIS的遺傳易感基因提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2015年4月-2016年7月鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內科住院并且確診的AIS患者300例及同期住院的健康個體300例，其性別、年齡均與AIS組相匹配。根據(jù)第4屆腦血管病學術會議的修訂的診斷標準，AIS的診斷經(jīng)臨床檢查（體征、病史、CT/MRI）確診。所有研究個體之間無血緣關系。所有參與個體均已簽署知情同意書，并獲得鄭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會的批準。AIS根據(jù)TOAST分型[6]，本室將其分為5個亞組：大動脈粥樣硬化型（LAA）、小動脈閉塞型（SAO）、心源性栓塞型（CE）、其他明確病因型（SODE）及其他不明原因型（SUE）亞組，分別研究其與MMP-3基因多態(tài)性相關程度。排除標準：癲癇、癌癥、出血性腦血管病及肝腎功能不全者、慢性炎癥、帕金森癥及綜合征。

1.2 基因型判定

1.2.1 標本采集及DNA的抽提 抽取所有研究患者的晨起空腹靜脈血3 ml，將其置EDTA-Na2抗凝管中，并放置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。本實驗提取DNA所用試劑為TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒。

1.2.2 SNaPshot多重單堿基延伸反應 PCR引物序列參照文獻設計，由生工生物工程（上海）有限公司合成。MMP-3-1612正向引物：5'-TTCTCCATTCCT TTGATGGGGGAAAGA-3'，反向引物：5'-TTATCTGTT GGGCTCCACTGTTTCTTCC-3'。MMP-3-1612反應條件：95℃ ×5 min，95℃ ×5 min，95℃ ×30 s，54℃ ×30 s，72℃×40 s，共35個循環(huán)，72℃×7 min，4℃保存。應用限制性內切酶Tth111Ⅰ在65℃孵育24 h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其基因型。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料及各組間的等位基因頻率和基因型頻率的比較采用χ2檢驗，本實驗采用SHEsis軟件進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，采用非條件Logisitic回歸分析，所得的相對風險度（）及95%CI對疾病發(fā)生的相對危險度及相關程度進行研究，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般臨床資料比較

本研究對兩組的年齡、性別等基本信息、危險因素及臨床檢驗資料進行比較。研究結果顯示，AIS組與對照組之間在性別、年齡構成方面差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對兩組之間危險因素研究發(fā)現(xiàn)，AIS組危險因素如高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心病）患者的比例與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），AIS組均高于對照組。兩組間的生化指標如血糖、低密度脂蛋白、同型半胱氨酸在兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 MMP-3-1612位點的凝膠電泳結果

野生型6A/6A基因型含有120 bp 1個條帶；5A/6A基因型含有120 bp和97 bp 2個條帶；5A/5A基因型者，只含有97 bp 1個條帶。見圖1。

表1 兩組一般臨床資料比較（n =300）

圖1 MMP-3-1612電泳圖

2.3 MMP-3-1612位點多態(tài)性分型結果

運用SHEsis軟件檢測發(fā)現(xiàn)，MMP-3基因位點-1612多態(tài)性基因型分布在AIS組和對照組中處于Hardy-Weinberg平衡（P=0.837和0.103），具有群體代表性。MMP-3-1612的基因型和等位基因頻率分布結果顯示，AIS組中的5A/5A基因型數(shù)目與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），AIS組高于對照組。在隱性模式中，AIS組中的5A/5A基因數(shù)目與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）AIS組高于對照組。見表2。

表2 基因型頻率與等位基因頻率在兩組間的比較 例（%）

2.4 MMP-3-1612位點多態(tài)性與AIS亞型的相關性

根據(jù)TOAST分型法[6]，將AIS組分為LAA組（104例）、SAO組（156例）、CE組（20例）、SODE組（5例）、SUE組（15例），分別研究MMP-3-1612位點與不同亞型的相關性，其中SODE型分別為煙霧病2例，凝血功能障礙3例。結果顯示5A/5A基因型數(shù)目在LAA組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），基因型數(shù)目有升高。見表3。

表3 AIS各亞型基因型頻率與等位基因頻率比較 例（%）

2.5 MMP-3-1612位點多態(tài)性基因型與腦梗死的關系

以MMP-3-1612基因多態(tài)性、低密度脂蛋白、血糖、高同型半胱氨酸、高血壓、糖尿病、冠心病為自變量，以腦梗死為因變量，采用Logistic回歸模型進行多因素分析，結果顯示MMP-3-1612基因多態(tài)性、低密度脂蛋白升高、血糖升高、高同型半胱氨酸、高血壓、冠心病、糖尿病均可增加LAA亞型的發(fā)病風險。見表4。

2.6 MMP-3-1612位點測序結果

為檢驗SNaPshot微測序技術分型結果的準確性，本實驗隨機抽取3種基因型的部分樣本進行測序。結果顯示，SNaPshot微測序技術的基因分型結果與測序結果完全一致。見圖2。

表4 MMP-3-1612位點的Logistic多因素回歸分析

圖2 MMP-3-1612位點基因型測序圖

3 討論

缺血性腦卒中的發(fā)生與環(huán)境因素和多個遺傳因素相關，基因變異也是缺血性腦卒中的重要發(fā)病因素之一。研究已經(jīng)表明腦血管疾病發(fā)生與年齡、性別、遺傳因素有關，且與高血壓、吸煙、糖尿病、高血脂癥、冠心病、高同型半胱氨酸血癥等有直接相關性[7]。、本項研究性別、年齡相匹配的AIS組與對照組比較發(fā)現(xiàn)，AIS組的血糖、高密度脂蛋白水平、同型半胱氨酸和對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，且AIS組高血壓、糖尿病、冠心病患者發(fā)病率較對照組增加，這與上述AIS的發(fā)病機制及危險因素的研究結果相符。在缺血性腦卒中預防中，可注意控制血壓、血糖、血脂、同型半胱氨酸等危險因素，從而減少缺血性腦卒中的發(fā)生。

MMPs在組織修復、細胞遷移、血管生成、組織形態(tài)形成及生長過程中扮演重要角色，生理條件下，MMPs與金屬蛋白酶特定組織抑制劑之間保持平衡，如果平衡破壞可能導致一系列病理過程，如動脈粥樣硬化，MMPs具有降解基質蛋白作用，可導致斑塊破裂、出血形成血栓，可影響缺血性腦卒中發(fā)病過程[2-3]。MMP-3是MMPs家族重要成員，它具有廣泛的底物特異性，可降低Ⅱ、Ⅳ和Ⅸ型膠原蛋白、纖維結合蛋白、膠質、蛋白聚糖、板層、和彈性蛋白活性，也可激活其他的MMPs，如膠原酶、基質裂素和明膠酶-B，對結締組織重塑至關重要[8-9]。

國外的研究如BETON等[10]和GHILARDI等[1]研究發(fā)現(xiàn)MMP-3啟動子5A/6A等位基因的6A基因與動脈粥樣硬化關系密切，其表達增加可加速動脈粥樣硬化進程。而FLEX等[11]研究MMP-3啟動子基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者與年齡性別匹配的對照組比較，MMP-3啟動子5A/5A基因型在病例組中高于對照組，考慮5A等位基因與急性缺血性腦卒中關系密切，是急性缺血性腦卒中危險因素。國內的研究如黃小亞等[12]研究發(fā)現(xiàn)急性動脈硬化型腦梗塞患者MMP-3水平增加，MMP-3啟動子5A等位基因可能為急性動脈硬化型腦梗死的遺傳易感基因。本研究在調整傳統(tǒng)危險因素后，Logistic回歸分析顯示，MMP-3-1612基因多態(tài)性可增加腦梗死的發(fā)病風險，提示MMP-3-1612位點基因突變與急性缺血性腦卒中相關。并且研究發(fā)現(xiàn)AIS組5A/5A基因型個體數(shù)目較對照組增加，認為攜帶5A/5A基因型的個體可能增加患缺血性腦卒中的發(fā)病風險，這與FLEX等[11]和黃小亞等[12]的研究結果一致，而與國外研究不一致，考慮與種族差異有關。分析原因，推測可能由于MMP-3-1612 5A/5A基因導致MMP-3基因轉錄水平增高，增加了斑塊裂解，導致動脈粥樣斑塊轉化為小且更容易破裂的斑塊，從而增加急性缺血性腦卒中發(fā)生的概率。

馬愛軍等[13]研究認為，MMP-3-1612血清水平在LAA型腦卒中急性期升高，且5A等位基因攜帶者（5A/5A+5A/6A）患LAA型腦卒中的風險大于6A/6A基因型攜帶者，認為MMP-3-1612基因多態(tài)性與LAA型腦卒中易感性相關，而本研究對AIS組各亞型進行分析時同樣發(fā)現(xiàn)，LAA型腦梗死5A/5A基因型數(shù)目增加。而LAA型為大動脈粥樣硬化型，動脈粥樣硬化為發(fā)病主要原因，同樣證實5A/5A基因可能通過參與動脈粥樣硬化過程從而增加急性缺血性腦卒中風險，但因亞組樣本有限，仍需大樣本研究證實。

本實驗結果發(fā)現(xiàn)5A/5A基因型可能為急性缺血性腦卒中的遺傳危險因素，可能成為急性缺血性腦卒中預防的重要靶點。但由于缺血性腦卒中是一種復雜的疾病，由多個微效易感基因及環(huán)境因素共同累加作用，且其危險因素與糖尿病、冠心病等存在重疊，可能會對實驗結果產生干擾。本研究急性缺血性腦卒中的易感基因，樣本含量較小，有必要在以后研究中擴大樣本，進行多位點，并進一步研究不同地區(qū)和不同種族的人群進行驗證，也可進一步從mRNA和蛋白水平進行更深入的研究，從而更深入的研究及探明該基因對急性缺血性腦卒中發(fā)生的作用及其機制，從而為急性缺血性腦卒中的基因水平治療提供更可靠的理論依據(jù)。