何育霖,李云龍,文一博,何翔飛,馮錦錦,馬 源,汪熙正,邢 棟,李 琦,陳 燕,徐鵬超,翟榮群,文建國(guó)

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，小兒尿動(dòng)力學(xué)中心和河南省小兒尿動(dòng)力國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450052)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為解決臨床問題做出了巨大的貢獻(xiàn)，很多疾病要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究其發(fā)生機(jī)制，從而指導(dǎo)藥物的研發(fā)和疾病診治[1]。隨著泌尿外科學(xué)的不斷發(fā)展，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在泌尿系統(tǒng)疾病研究中的作用也越來越重要[2]。下尿路功能障礙是泌尿外科研究中的一個(gè)重要方向，比如膀胱過度活動(dòng)癥(overactive bladder，OAB)、下尿路癥狀(lower urinary tract symptoms,LUTS)、神經(jīng)源性膀胱(neurogenic bladder,NB)等等[3-6]。以大鼠為研究對(duì)象的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在這些疾病的發(fā)病機(jī)制及診療方法的研究中發(fā)揮著巨大的作用。而對(duì)這些疾病動(dòng)物模型的研究，一個(gè)必不可少的膀胱功能檢測(cè)方法就是大鼠的膀胱測(cè)壓技術(shù)，因?yàn)樗悄壳皺z測(cè)膀胱功能的金標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。目前常用的大鼠膀胱測(cè)壓方法是麻醉狀態(tài)下膀胱測(cè)壓和清醒狀態(tài)下膀胱測(cè)壓[9-10]。但不同的麻醉狀態(tài)(淺麻醉和深麻醉)對(duì)尿動(dòng)力結(jié)果可能會(huì)有一定的影響，因此，了解大鼠在兩種狀態(tài)下膀胱測(cè)壓結(jié)果的差異，對(duì)我們研究大鼠模型的膀胱功能十分重要，進(jìn)而使動(dòng)物模型更好地服務(wù)于臨床。然而目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于不同麻醉狀態(tài)對(duì)大鼠膀胱測(cè)壓的影響及與清醒狀態(tài)膀胱測(cè)壓結(jié)果比較的研究較少，故本研究擬探討不同麻醉狀態(tài)下大鼠的膀胱測(cè)壓結(jié)果與清醒狀態(tài)膀胱測(cè)壓結(jié)果的差異，為動(dòng)物膀胱測(cè)壓研究提供參考。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象18～24周齡SD雄性大鼠13只體重350～400 g，由河南省動(dòng)物中心提供。

1.2材料和儀器膀胱測(cè)壓導(dǎo)管:一次性使用。靜脈輸液針(蘇云)后面的軟管(外徑2.5 mm,內(nèi)徑1.5 mm)，軟管的一端用火機(jī)燒成小領(lǐng)口(可以預(yù)防軟管從膀胱脫出)。膀胱測(cè)壓裝置：BL-420/820生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)，微量注射泵(德國(guó)貝朗)。麻醉藥物:水合氯醛(科密歐國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)。

1.3大鼠麻醉狀態(tài)評(píng)定應(yīng)用ANTUNES等[11]報(bào)道的大鼠肢體反應(yīng)麻醉評(píng)分法評(píng)定大鼠的麻醉深度(評(píng)分表見表1),1分為深麻醉狀態(tài)，4分為淺麻醉狀態(tài)。采用10%水合氯醛氯化鈉水溶液0.3 mL/100 g麻醉大鼠，麻醉生效后，對(duì)大鼠行膀胱造瘺術(shù)，術(shù)后根據(jù)大鼠的肢體行為給大鼠進(jìn)行麻醉評(píng)分，對(duì)于評(píng)分為1分的直接進(jìn)行膀胱測(cè)壓，大于1分的給大鼠適當(dāng)追加麻醉藥使其評(píng)分達(dá)到1分后再進(jìn)行膀胱測(cè)壓。深麻醉測(cè)壓后繼續(xù)觀察大鼠，當(dāng)大鼠恢復(fù)至評(píng)分為4分時(shí)再給大鼠進(jìn)行淺麻醉狀態(tài)膀胱測(cè)壓。

1.4大鼠膀胱測(cè)壓

1.4.1大鼠膀胱頂造瘺 麻醉(10%水合氯醛氯化鈉水溶液0.3 mL/100 g麻醉)生效后，行下腹正中切口長(zhǎng)約1～2 cm，顯露膀胱頂部，先用4-0帶線滌綸縫合針(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品辜負(fù)有限公司)在膀胱頂部先荷包式縫合一周，在荷包中間用4.5號(hào)針頭于膀胱頂部刺穿膀胱后用顯微鑷尖擴(kuò)張穿刺孔，將靜脈輸液針軟管袖頭通過穿刺孔插入膀胱，之后扎緊荷包，在劍突下1.5 cm處皮膚切開長(zhǎng)約1 cm小口，用16號(hào)針頭穿刺腹壁后將軟管由穿刺孔從腹腔引出，并于穿刺孔處用4號(hào)絲線將軟管固定一針，之后用4號(hào)絲線縫合腹直肌前鞘及下腹部切口，用無菌紗布保護(hù)上腹部切口翻轉(zhuǎn)大鼠至俯臥位在頸部正中用剪刀剪開長(zhǎng)約0.7 cm的小口，用眼科剪分離皮下，然后翻轉(zhuǎn)大鼠至仰臥位，在上腹部切口處于皮下用彎鉗分離隧道至頸部切口，將軟管從劍突下出口經(jīng)皮下隧道在頸部背側(cè)穿出，并于頸部切口用4號(hào)絲線固定一針。然后翻轉(zhuǎn)大鼠至仰臥位用4號(hào)絲線縫合上腹部切口，大鼠膀胱造瘺完成。

1.4.2深麻及淺麻程度下大鼠膀胱測(cè)壓 將造瘺后的大鼠俯臥位固定四肢，將T型管一個(gè)側(cè)管連接灌注泵，另一側(cè)管連接膀胱測(cè)壓管，T型管的匯總管連接BL-420/820生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的測(cè)壓通道。微量泵應(yīng)用20 mL注射器作為灌注容器。將大鼠恥骨聯(lián)合位置放置于測(cè)壓傳感器插頭位置等高，打開電腦BL-420/820生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)界面，應(yīng)用的通道設(shè)置為壓力感受通道，啟動(dòng)壓力檢測(cè)，開啟灌注泵將T型管軟管中的空氣排凈，將膀胱測(cè)壓管在大鼠操作臺(tái)平面(相當(dāng)于大鼠恥骨聯(lián)合位置)調(diào)零后與大鼠背側(cè)造瘺管連接，開啟灌注泵，以0.1 mL/min的速度向膀胱灌注18 ℃的生理鹽水，在BL-420/820生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄膀胱壓力曲線。觀察至壓力曲線穩(wěn)定后出現(xiàn)3個(gè)排尿周期，同時(shí)觀察大鼠尿道口的排尿情況。在大鼠深麻及淺麻醉狀態(tài)時(shí)記錄大鼠的膀胱壓力曲線，并觀察大鼠尿道口的排尿情況。

1.4.3清醒狀態(tài)下大鼠膀胱測(cè)壓 術(shù)后第2天大鼠已徹底清醒并能自如活動(dòng)，將大鼠放置于限制性鼠籠中，同法準(zhǔn)備好大鼠膀胱測(cè)壓設(shè)備后將大鼠的背側(cè)膀胱造瘺管塞子取下，將膀胱測(cè)壓管端口對(duì)準(zhǔn)鼠籠底部(相當(dāng)于大鼠恥骨聯(lián)合位置)調(diào)零后與大鼠背側(cè)造瘺管連接，膀胱灌注生理鹽水速度0.1 mL/min,開啟灌注泵開始膀胱測(cè)壓，同時(shí)觀察膀胱排尿情況。

1.5觀察指標(biāo)大鼠不同狀態(tài)下的充盈期膀胱基礎(chǔ)壓、排尿期最大膀胱壓、排尿間隔、功能膀胱容量和膀胱順應(yīng)性。充盈期基礎(chǔ)膀胱壓：大鼠每次排完尿液后的膀胱壓力；功能膀胱容量：兩次排尿間隔期間的膀胱容量改變值；膀胱順應(yīng)性:膀胱充盈期的值。測(cè)壓方法符合國(guó)際尿控協(xié)會(huì)規(guī)定的膀胱壓力容積測(cè)定的基本原則。

2 結(jié) 果

2.1深麻醉狀態(tài)下膀胱測(cè)壓結(jié)果13只大鼠均手術(shù)順利，無大鼠死亡。大鼠在深麻醉狀態(tài)下，膀胱沒有收縮力，膀胱充盈到一定程度出現(xiàn)充盈性尿失禁，膀胱漏點(diǎn)壓(bladder leak point pressure，BLPP)為(33.101±7.189)cmH2O(圖1)，該狀態(tài)下的膀胱順應(yīng)性為(0.017 4±0.012 6) mL/cmH2O。

2.2淺麻醉狀態(tài)下的膀胱測(cè)壓結(jié)果大鼠在淺麻醉狀態(tài)下有意識(shí)存在，大鼠膀胱可瞬時(shí)收縮，大鼠均可自行排尿。該狀態(tài)下大鼠的基礎(chǔ)膀胱壓、排尿間隔、功能膀胱容量、膀胱順應(yīng)性、排尿期最大膀胱壓分別為：(11.490±7.312)cmH2O、(156.306±81.327)s、(0.261±0.136)mL、(0.089 4±0.092 2)mL/cmH2O、(32.027±6.309)cmH2O(表2)。

2.3清醒狀態(tài)下的膀胱測(cè)壓結(jié)果清醒狀態(tài)下大鼠的基礎(chǔ)膀胱壓、排尿間隔、功能膀胱容量、膀胱順應(yīng)性、排尿期最大膀胱壓分別為：(10.777±4.386)cmH2O、(237.057±124.388)s、(0.389±0.202)mL、(0.104±0.136)mL/cmH2O、(38.144±7.974)cmH2O。

2.4大鼠三個(gè)不同狀態(tài)下膀胱測(cè)壓結(jié)果配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示：淺麻醉狀態(tài)下大鼠的排尿期最大膀胱壓顯著小于清醒狀態(tài)[(32.027±6.309)cmH2Ovs.(38.144±7.974)cmH2O,P<0.05]，同時(shí)淺麻醉時(shí)的排尿間隔和膀胱功能容量也顯著小于清醒狀態(tài)[(156.306±81.327)svs. (237.057±124.388)s，(0.261±0.136)mLvs.(0.389±0.202)mL),P<0.05],在淺麻醉和清醒狀態(tài)大鼠的膀胱順應(yīng)性和基礎(chǔ)膀胱充盈壓沒有顯著性差異[(0.089 4±0.092 2)mL/cmH2Ovs.(0.104±0.136)mL/cmH2O，(11.490±7.312)cmH2Ovs. (10.777±4.386)cmH2O,P>0.05]，深麻醉狀態(tài)下的膀胱順應(yīng)性[(0.017 4±0.012 6)mL/cmH2O]較淺麻醉[(0.089 4±0.092 2) mL/cmH2O]及清醒狀態(tài)[(0.104±0.136) mL/cmH2O]低(P<0.05)。比較結(jié)果詳見表3、圖1。

表1麻醉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

分值身體表現(xiàn)1被鉗夾刺激肢體沒有反應(yīng),呼吸深而慢。2被鉗夾刺激肢體僅有輕度肌顫但不能活動(dòng)。3被鉗夾刺激肢體有輕度的蜷縮活動(dòng),但身體無法移動(dòng)。4 被鉗夾刺激肢體有明顯的蜷縮活動(dòng),偶爾大鼠會(huì)移動(dòng)身體到別處,呼氣頻率加快。5 開始有輕度的胡須活動(dòng),角膜刺激時(shí)有眨眼動(dòng)作,被鉗夾肢體快速蜷縮并有其他肢體的快速活動(dòng)及身體移動(dòng)。

1分：深麻醉狀態(tài)；2～3分：適度麻醉狀態(tài)；4分：淺麻醉狀態(tài)；5分：輕微麻醉狀態(tài)。

麻醉狀態(tài)基礎(chǔ)膀胱壓(cmH2O)排尿間隔(s)功能膀胱容量(mL)膀胱順應(yīng)性(mL/cmH2O)排尿期最大膀胱壓(cmH2O)淺麻醉11.490±7.312156.306±81.3270.261±0.1360.089 4±0.092 232.027±6.309深麻醉---0.017 4±0.012 6-清醒10.777±4.386237.057±124.3880.389±0.2020.104±0.13638.144±7.974

表3 配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果(n=13)

*有顯著性差異。

圖1 同一只大鼠不同狀態(tài)下的膀胱測(cè)壓結(jié)果

3 討 論

大鼠膀胱測(cè)壓是一項(xiàng)重要的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在膀胱功能的檢測(cè)中有不可替代的作用,它可以準(zhǔn)確地評(píng)估膀胱功能，是評(píng)估膀胱功能的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。目前大鼠的膀胱測(cè)壓常用的有兩種，清醒狀態(tài)下測(cè)壓和麻醉狀態(tài)下測(cè)壓[13-15]，其各自的特點(diǎn)尚未完全明了。我們本次研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用水合氯醛進(jìn)行麻醉，大鼠在淺麻下膀胱可以自主收縮，但收縮力較清醒狀態(tài)弱，這和STRENG等[16]的研究結(jié)果相似，這可能是因?yàn)槁樽硭帉?duì)大腦或膀胱神經(jīng)的麻醉作用引起，也可能該麻藥對(duì)膀胱平滑肌本身也有作用。相對(duì)于淺麻醉，清醒狀態(tài)下膀胱有更好的排空能力，排尿間隔也更長(zhǎng)，這可能是因?yàn)槁樽硭幙梢詼p弱膀胱排尿時(shí)的逼尿肌收縮力，導(dǎo)致大鼠的膀胱排空能力下降，結(jié)果大鼠每次排尿后膀胱的殘余尿量增加，而膀胱的最大容量沒有增加，導(dǎo)致膀胱的功能容量減小，排尿間隔就減小了。

本研究發(fā)現(xiàn)在淺麻醉和清醒狀態(tài)雄性大鼠的基礎(chǔ)膀胱壓和膀胱順應(yīng)性差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能淺麻醉狀態(tài)下麻醉藥對(duì)膀胱的基礎(chǔ)壓及順應(yīng)性沒有影響。但是我們發(fā)現(xiàn)在深麻狀態(tài)下大鼠的膀胱順應(yīng)性較淺麻及清醒狀態(tài)是下降的，這可能和我們測(cè)量深麻醉狀態(tài)時(shí)沒有在充盈膀胱前排空膀胱有關(guān)，但也有可能在深麻醉狀態(tài)下大鼠的膀胱順應(yīng)性會(huì)降低，具體原因有待將來進(jìn)一步研究。

本研究顯示清醒測(cè)壓是可行的，大鼠性格較溫順，清醒狀態(tài)下造瘺后的大鼠可以配合實(shí)驗(yàn)者完成膀胱測(cè)壓。雖然大鼠清醒時(shí)的活動(dòng)及緊張會(huì)影響膀胱測(cè)壓結(jié)果，但當(dāng)大鼠在限制性鼠籠待30 min以后，大鼠就會(huì)平靜下來，這是可以排除這些干擾的。結(jié)果也表明恥骨上造瘺測(cè)壓法是一種很好的大鼠膀胱測(cè)壓法，應(yīng)用這種方法無論雌鼠或者雄鼠均可用進(jìn)行膀胱測(cè)壓，如果應(yīng)用尿道插管測(cè)膀胱壓，因雄性大鼠尿道長(zhǎng)而曲折是很難進(jìn)行的。本研究還顯示在淺麻狀態(tài)下大鼠有意識(shí)，可以自行排尿，雖然大鼠膀胱收縮力及排尿功能會(huì)部分減弱，但依然可以反映大鼠的膀胱功能。雖然淺麻醉狀態(tài)對(duì)大鼠膀胱功能有一定的影響，但大鼠在淺麻下容易管理，可以經(jīng)尿道插管，也可以經(jīng)肛門插管測(cè)腹壓[17]，淺麻醉行膀胱測(cè)壓有它的優(yōu)勢(shì)和可行性。對(duì)于一些特殊要求的膀胱測(cè)壓實(shí)驗(yàn)，首選麻醉狀態(tài)下膀胱測(cè)壓，如研究活體大鼠的膀胱失神經(jīng)支配的膀胱功能檢測(cè)[18]。

清醒狀態(tài)膀胱測(cè)壓和麻醉狀態(tài)膀胱測(cè)壓各有利弊，清醒測(cè)壓可以排除麻醉藥物的干擾，使測(cè)壓結(jié)果更貼近大鼠膀胱功能的生理狀態(tài)，但大鼠清醒狀態(tài)較難操控。麻醉狀態(tài)測(cè)壓大鼠容易操控，但測(cè)壓結(jié)果可能受到麻醉藥物的一定影響。清醒狀態(tài)下大鼠膀胱測(cè)壓一般在判斷制作的下尿路功能障礙大鼠模型膀胱功能評(píng)估時(shí)應(yīng)用，這樣可以更貼近大鼠膀胱病理生理狀態(tài)，更容易確認(rèn)膀胱功能障礙的存在與否。例如我們制作膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction,BOO)大鼠模型中，檢測(cè)大鼠膀胱是否已經(jīng)被梗阻，在制作膀胱活動(dòng)過度癥(overactive bladder,OAB)OAB模型中檢測(cè)大鼠膀胱是否存在逼尿肌過度活動(dòng)及排尿間隔縮短。這些實(shí)驗(yàn)需要在大鼠身上同時(shí)做的操作較少，不需要對(duì)大鼠進(jìn)行嚴(yán)格的控制。但對(duì)于需要嚴(yán)格控制的復(fù)雜大鼠實(shí)驗(yàn)，同時(shí)又要進(jìn)行大鼠的膀胱測(cè)壓，淺麻醉下大鼠膀胱測(cè)壓就比較方便，例如實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)測(cè)腹壓，需要同時(shí)進(jìn)行藥物靜脈注入，需要同時(shí)進(jìn)行手術(shù)操作或進(jìn)行上尿路的壓力檢測(cè)等等。

清醒測(cè)壓時(shí)大鼠在自由活動(dòng)中可能會(huì)出現(xiàn)測(cè)壓連接管的脫落及扭轉(zhuǎn)，我們的經(jīng)驗(yàn)是應(yīng)用較小的限制性鼠籠，不少文獻(xiàn)里說應(yīng)用代謝籠，但其體積太大，我們應(yīng)用的是直徑27 cm×16 cm ×13 cm的微型鼠籠加上一個(gè)7 cm高的金屬網(wǎng)格蓋子，效果挺好，連接管很少脫落，另外我們采用分段連接，即在鼠籠上方設(shè)置銜接口，可以隨時(shí)拆卸，這樣就可以隨時(shí)在籠外卸下抽取殘余尿，也避免了直接接觸動(dòng)物，另外就是鼠籠中的銜接管盡量軟一些，這樣可以避免扭轉(zhuǎn)產(chǎn)生的管道堵塞，如果扭轉(zhuǎn)過度可以通過籠外的銜接口調(diào)整扭轉(zhuǎn)。調(diào)零：我們以大鼠所在籠底為零點(diǎn)，因?yàn)榇笫笃届o后喜歡趴在籠底，大鼠的恥骨聯(lián)合貼近籠底，一旦調(diào)零后接上大鼠膀胱測(cè)壓管，機(jī)器的零點(diǎn)不會(huì)隨大鼠的移動(dòng)改變，除非管內(nèi)有空氣，如果那樣我們要排凈空氣后重新調(diào)零。

實(shí)驗(yàn)中我們雖然僅檢測(cè)了術(shù)后第1天大鼠的尿動(dòng)結(jié)果，但我們觀察了雄性大鼠長(zhǎng)期帶膀胱造瘺管的情況，因該管直徑較粗，長(zhǎng)期帶管容易引起大鼠的前列腺炎及精囊炎，所以如要長(zhǎng)期觀察大鼠的膀胱功能情況，我們建議應(yīng)用直徑更細(xì)的管子PE50管[19-21]，這種造瘺管更細(xì)，即使長(zhǎng)期放置也不容易造成泌尿生殖系統(tǒng)感染，可以避免膀胱及生殖系統(tǒng)炎癥對(duì)膀胱測(cè)壓的影響。

總之，我們研究發(fā)現(xiàn)淺麻醉和清醒狀態(tài)的尿動(dòng)力學(xué)部分參數(shù)指標(biāo)是有差異的，淺麻醉狀態(tài)對(duì)膀胱的收縮能力有一定負(fù)面影響。我們應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求合理選擇大鼠的尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)方法。