于 洋 李 垚 林宇涵

(錦州醫(yī)科大學生理學教研室，遼寧 錦州 121001)

胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)及其血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的最重要和最根本原因〔1〕。糖尿病(DM)代謝紊亂時造成的氧化應激(OS)不但是T2DM及血管并發(fā)癥的重要機制，也是導致IR狀態(tài)下內皮細胞功能不全(ECD)發(fā)病機制中重要的作用環(huán)節(jié)〔2〕。 “補陰方藥之祖”六味地黃丸(LWDHP)具有抗OS、降糖降脂之功效，臨床應用其治療因OS引起的DM取得非凡的效果〔3〕。本實驗通過研究LWDHP對IR狀態(tài)內皮細胞的活性氧(ROS)含量、非(不)對稱二甲基精氨酸(ADMA)濃度及相關基因二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)2表達的影響，以期揭示LWDHP對IR的作用及改善機制。

1 材料與方法

1.1細胞株 EA.hy926人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2主要試劑 LWDHP(濃縮丸)，北京同仁堂(國藥準字Z19993068)；DDAH2一抗，鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗，美國Proteintech Group公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗，Cell Signaling Technology公司；RT-PCR試劑盒，TaKaRa公司；軟脂酸(PA)，Sigma公司；二甲雙胍(MET)，上海生工生物工程有限公司；ADMA的酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；ROS檢測試劑盒、DCFH-DA熒光探針，碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3LWDHP中藥組含藥血清的制備 SPF級SD大鼠〔遼寧長生生物技術有限公司，許可證號：SCXK(遼)2010-0001〕，體質量300～350 g，雌雄各半。標準環(huán)境下適應性喂養(yǎng)3 d后，按隨機數(shù)字法分為兩組，34只為正常對照組，18只為LWDHP中藥組。中藥組給予LWDHP粉末水溶液(生藥質量濃度為15 g·kg-1·d-1)灌胃，3 ml/次/只，2次/d；正常對照組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃5 d。第6天于末次給藥1～2 h后10%水合氯醛腹腔麻醉，1.5 ml/只，打開腹腔，腹主動脈采血，血液自然凝固分離血清，56℃水浴滅活30 min，過濾除菌，分裝，封口，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4ELISA法檢測細胞培養(yǎng)基中ADMA濃度 調整細胞密度為0.5×105個/ml接種到96孔培養(yǎng)板中，分為正常對照組、模型組(PA組)、LWDHP中藥組(2.5%、5.0%、10.0%含藥血清)、MET組，于37℃、5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)。待細胞90%生長融合后，正常對照組、PA組和MET組加入無血清的DMEM培養(yǎng)基及空白血清(終濃度為20%)；LWDHP中藥組加入LWDHP含藥血清，終濃度分別為2.5%、5.0%、10.0%，另以空白血清將血清終濃度補充為20%；MET組加入MET使其終濃度為2 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)干預保護24 h。加入PA使其終濃度為400 μmol/L，孵育1 h后，再加入胰島素使其終濃度為50 nmol/L，PA作用細胞24 h后，收集各組培養(yǎng)基。按照ADMA濃度檢測試劑盒的步驟進行操作，用酶標儀在450 nm波長下測定OD值，通過標準曲線計算樣品中ADMA濃度。

1.5細胞內ROS檢測 6孔培養(yǎng)板接種HUVEC，當細胞貼壁生長至70%～80%融合度，藥物處理同1.4，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次，然后加入10 μmol/L DCFH-DA,培養(yǎng)箱內孵育30 min，每隔3～5 min顛倒混勻一次，使探針和細胞充分接觸。用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。使用多功能酶標儀在488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長下檢測熒光強度。

1.6RT-PCR測定細胞DDAH2 mRNA的表達 將細胞按5×105個/ml 密度接種到25 cm2培養(yǎng)瓶內，分成正常對照組、PA組、5% LWDHP含藥血清治療組、MET組。各組細胞藥物處理同1.4，收集細胞，提取細胞總RNA。隨后用RT-PCR 試劑盒進行逆轉錄及聚合酶鏈反應。β-actin上游引物序列：5′-ACACGAAAGCAATGCTATCACCTC-3′，下游引物序列：5′-TGACAGCAGTCGGTTGGAGCGA-3′，擴增片段長度153 bp。反應條件為94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，40個循環(huán)。DDAH2上游引物序列：5′-TTCTCCACCAACTCTGTCCTC-3′，下游引物序列：5′-CAACCGCTCGGATTTCTTA-3′，擴增片段長度124 bp。反應條件：退火56℃，32個循環(huán)。通過凝膠成像系統(tǒng)以DDAH2條帶光密度值和對應的β-actin條帶光密度值的比值表示DDAH2 mRNA的表達量。

1.7Western印跡測定細胞DDAH2蛋白表達 細胞分組同1.6，加藥處理同1.4，收集細胞提總蛋白。調整各組的蛋白質上樣量(40 μg)，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，轉膜，5%脫脂奶粉37℃水浴震蕩封閉1 h，加入DDAH2一抗(1∶500稀釋)，4℃過夜。含吐溫-20的Tris緩沖液(TBST)清洗3次，5 min/次，HRP標記IgG二抗(1∶2 000稀釋)，TBST清洗4次，5 min/次，37℃水浴震蕩2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，掃描條帶，以GAPDH作為內參，DDAH2和GAPDH蛋白表達強度進行灰度比值顯示DDAH2相對表達量。

1.8統(tǒng)計學方法 使用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析后進行組間LSD分析。

2 結 果

2.1各組細胞培養(yǎng)基中ADMA濃度測定 模型組ADMA濃度〔(7.61±0.55)μmol/L〕明顯增高，與正常對照組〔(3.57±0.32)μmol/L〕比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。2.5% LWDHP含藥血清組的ADMA濃度〔(7.18±0.44)μmol/L〕降低不明顯，與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，5.0%和10.0% LWDHP含藥血清和MET能顯著降低ADMA濃度，分別為(5.96±0.27)，(5.73±0.35)，(5.96±0.47)μmol/L，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2各組細胞內ROS含量的檢測 模型組細胞內ROS含量(70.26±1.61)明顯增高，與正常對照組(20.69±1.34)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。2.5% LWDHP含藥血清組的ROS含量(68.25±0.55)降低不明顯，與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，5.0%和10.0% LWDHP含藥血清和MET能顯著降低ROS含量(分別為52.58±0.66，54.47±0.97，56.50±1.10)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3LWDHP對細胞DDAH2 mRNA表達的影響 與正常對照組(0.476 2±0.000 1)比，PA組(0.335 6±0.001 1)細胞內DDAH2 mRNA的表達量顯著降低(P<0.01)。與PA組比，5% LWDHP含藥血清組(0.458 8±0.000 7)和MET組(0.577 2±0.000 6)細胞內DDAH2 mRNA表達量明顯升高(P<0.01)，說明 LWDHP預處理可以促進PA誘導的EA.hy926細胞內DDAH2 mRNA的表達量。見圖1。

圖1 各組細胞DDAH2 mRNA表達的比較

2.4LWDHP對細胞DDAH2 蛋白表達的影響 與正常對照組(0.286 6±0.000 4)比較，PA組(0.110 9±0.000 3)細胞內DDAH2蛋白的表達量顯著下降(P<0.01)。5% LWDHP含藥血清組(0.350 4±0.000 7)和MET組(0.271 9±0.000 3)與PA組比較，細胞內DDAH2蛋白表達量均升高(P<0.01)，意味著 LWDHP同樣也可以促進PA誘導的EA.hy926細胞內DDAH2蛋白的表達。見圖2。

圖2 各組細胞DDAH2 蛋白表達的比較

3 討 論

IR是指各種原因使胰島素作用的靶器官或靶組織對內源性或外源性胰島素的敏感性及反應性下降，葡萄糖攝取和利用的效率下降，機體代償性分泌過多胰島素產生高胰島素血癥。目前認為DM的病理發(fā)病基礎之一是IR〔4〕。有學者提出“共同土壤學說”，即OS是IR、DM和心血管疾病的共同發(fā)病基礎，目前已經成了不爭的事實。而且在OS導致的疾病中，與IR及DM的關系一直是國內外學者研究的熱點〔5〕。

有學者認為IR引起的ECD會導致內皮細胞(EC)產生更多的ROS〔6〕。有實驗已經證明PA損傷HUVEC后,細胞裂解液中的抗氧化酶總超氧化物歧化酶(SOD)活性下降，氧自由基最重要的終產物之一丙二醛(MDA)含量增高，ROS產生的關鍵酶NADPH 氧化酶(NOX)4 mRNA和蛋白的表達量明顯升高〔7〕。本實驗研究也證明了PA損傷HUVEC造成IR狀態(tài)后，細胞內ROS含量明顯增高，就說明IR會使EC嚴重受損,膜的完整性被破壞,更加證明了PA可通過NOX4誘導EC產生ROS，從而對細胞造成氧化損傷。

ADMA是一種廣泛存在于組織和細胞中的天然氨基酸，近幾年已經成為一種新的心血管疾病的危險因子。臨床實驗研究表明，T2DM患者在內皮依賴性血管舒張功能減弱的同時會有ADMA水平升高，而且ECD的嚴重程度與血漿中ADMA水平呈正相關，就能夠推測ADMA可能是IR與DM及其血管并發(fā)癥發(fā)生的一種強大的而且獨立的評價血管ECD一種新的危險預測因子〔8〕。90%以上的ADMA是在DDAH2的作用下降解失活的，生成胍氨酸、二甲基或單甲基，經腎臟排出體外。因此，DDAH2活性大小對調節(jié)ADMA的水平起著關鍵性作用，那么導致DDAH2活性降低的因素均可引起ADMA濃度增加〔9〕。本實驗中在PA損傷HUVEC后，檢測到細胞培養(yǎng)基中ADMA濃度明顯增高，細胞內DDAH2 mRNA和蛋白的表達量顯著降低，推測損傷的EC中ADMA-DDAH2代謝軸存在異常，說明ECD時造成的OS反應導致了DDAH2下降，從而增加了ADMA濃度，進一步加重OS反應。

氣虛陰虧是DM 發(fā)生的基本病因病機，LWDHP是滋補氣陰兩虛的傳統(tǒng)名方，臨床上用以治療DM顯現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢〔10〕。有學者對LWDHP清除自由基、抗氧化的作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)LWDHP能提高睡眠剝奪大鼠血清SOD活性，加速自由基清除〔11〕。本實驗研究表明LWDHP含藥血清能顯著降低ROS含量，同時促進細胞內DDAH2 mRNA和蛋白的表達，從而降低ADMA的含量，證明LWDHP含藥血清能降低PA對HUVEC的氧化損傷程度，抑制OS反應，增強抗氧化作用，有助于改善受損血管EC功能。