劉堅(jiān)榮, 毛紅嬌, 郭高力, 傅晶蕾, 童 夏, 錢沁清, 駱華剛, 張 云

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 浙江 紹興 312000)

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療終末期關(guān)節(jié)疾患、重建關(guān)節(jié)功能的重要手段。然而，隨著關(guān)節(jié)置換病例的增加和時間的延長，假體晚期松動問題日益突出。大量研究表明，聚乙烯(polyethylene，PE)、鈦(titanium，Ti)和磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)等關(guān)節(jié)假體經(jīng)過長期磨損產(chǎn)生的大量的磨損顆粒聚集于假體表面，刺激假體周圍單核細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等組織細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素1β(interleukin-1beta，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)等炎癥因子[1-2]，引起體內(nèi)一系列持續(xù)性炎癥反應(yīng)，使得局部破骨細(xì)胞生成增加，最終造成假體周圍炎癥性骨溶解和關(guān)節(jié)松動[2-5]。因此，磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解是引起關(guān)節(jié)松動和翻修的主要原因之一。

最近有研究顯示，松動假體周圍組織中氧化應(yīng)激產(chǎn)物谷胱甘肽(glutathione, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量顯著增加[6-8]，提示氧化應(yīng)激可能在磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解中發(fā)揮重要作用，但具體機(jī)制尚不明確。本研究應(yīng)用TCP磨損顆粒構(gòu)建小鼠假體周圍骨溶解模型，同時引入抗氧化劑N-乙酰L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)，探討氧化應(yīng)激在TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解中的作用，并闡明其可能作用機(jī)制，為防治假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動提供新的治療靶標(biāo)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型建立

SPF級雄性ICR小鼠購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心(SCXK(浙)2014-0001)。實(shí)驗(yàn)前動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度(22～24)℃、相對濕度(50～70) %，動物自由進(jìn)食、進(jìn)水，自然晝夜節(jié)律光照。取36只6周齡雄性ICR小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、TCP磨損顆粒(TCP)組和N-乙酰L-半胱氨酸(NAC)組，每組12只。腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，無菌條件下取顱頂正中矢狀切口，長約0.8 cm。分離皮下組織，顯露出1 cm×1 cm顱骨區(qū)域。其中Sham組行原位縫合，其余兩組取TCP磨損顆粒(30 mg)置于顱頂處后縫合皮膚。NAC組小鼠于術(shù)后第2天于顱頂骨膜部位注射NAC(1.0 mg/kg)，隔日注射1次，持續(xù)2周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠眼眶后靜脈叢取血；同時取出顱骨(以正中矢狀縫為中心的方形區(qū)域)，PBS清洗，用濾紙吸去多余水分后用分析天平稱量顱骨濕重(mg)。

1.2 藥品與試劑

TCP磨損顆粒由浙江大學(xué)化學(xué)系饋贈。鱟試劑購自上海吳昊經(jīng)貿(mào)有限公司。TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒，ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。T-AOC試劑盒、SOD試劑盒、RIPA裂解液和NAC購自碧云天生物試劑有限公司。多聚甲醛和EDTA購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。兔抗GRP78抗體、兔抗PERK抗體、兔抗p-PERK抗體、兔抗eIF2α抗體、兔抗p-eIF2α抗體和小鼠抗β-actin抗體購自Cell Signaling公司。PVDF膜購自Millipore公司。

1.3 采血并制備血清

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠分別于眼眶后靜脈叢采血1.0 ml置于EP管中，待血液凝固后于4 ℃、3000 r/min離心10 min，分離血清。

1.4 TRAP染色觀察假體周圍骨溶解

各組小鼠的顱骨經(jīng)4%多聚甲醛液固定10 min，0.25 mol/L氫氧化銨超聲清洗5 min。然后置于系列乙醇(50%，80%，90%，100%)中梯度脫水，自然晾干后加入TRAP染色液中室溫避光染色60 min。蒸餾水清洗后，置IX70顯微鏡下觀察TCP磨損顆粒植入部位周圍的骨溶解情況。

1.5 化學(xué)比色法檢測血清T-AOC含量和SOD活性[9]

分別采用T-AOC和SOD試劑盒檢測小鼠血清中T-AOC含量和SOD活性。

1.6 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β和IL-6的水平

取96孔板，每孔加入50 μl血清，分別按照TNF-α、IL-1β和IL-6ELISA檢測試劑盒說明書，測定血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.7 Western blot法檢測蛋白質(zhì)表達(dá)[10]

每組取等質(zhì)量假體周圍顱骨組織置于研缽內(nèi)，在液氮環(huán)境下研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)移至EP管中。加入RIPA裂解液800 μl裂解30 min，于4℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液。采用BCA法檢測各組總蛋白質(zhì)濃度。加入上樣緩沖液后煮沸10 min，冷卻后每孔上樣30 μg蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶常溫孵育2 h后，用兔抗GRP78(1∶1 000稀釋)、兔抗PERK(1∶1 000稀釋)、兔抗p-PERK(1∶1 000稀釋)、兔抗eIF2α(1∶1 000稀釋)、兔抗p-eIF2α(1∶1 000稀釋)及鼠抗β-actin(1∶1 000稀釋)等單克隆抗體于4℃孵育過夜。次日用TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次后加入ECL顯色液。通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白質(zhì)含量的變化。每個樣品重復(fù)檢測3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清炎性因子水平的比較

與Sham組比較，TCP組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯增高，分別為Sham組的1.24倍、3.54倍和1.44倍(P<0.05)；與TCP組比較，NAC組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯減低，分別減少18.2%、42.5%和32.5%(P<0.05，表1)，表明NAC可抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的炎性因子釋放。

GroupsTNF-αIL-1βIL-6Sham65.41±2.732.42±2.543.65±1.3TCP80.81±3.1*114.86±6.6*63.02±2.1*NAC66.13±1.9#66.05±2.9#42.53±3.4#

TNF-α: Tumor necrosis factor-alpha; IL-1β: Interleukin-1beta; IL-6: Interleukin-6; TCP: Tricalcium phosphate; NAC: N-acetyl-L-cysteine

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group

2.2 各組小鼠假體周圍骨溶解水平的比較

TRAP染色結(jié)果顯示：與Sham組比較，TCP組小鼠顱骨正中矢狀縫發(fā)生明顯大面積骨溶解、顱骨濕重明顯減少，其骨溶解面積和顱骨濕重分別是假手術(shù)組的2.64倍和62.6%(P<0.05)；與TCP組比較，NAC組小鼠顱骨假體周圍骨溶解面積減少58.5%，而顱骨濕重增加29.0%(圖1，P<0.05)。提示NAC能阻止TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的小鼠假體周圍骨溶解。

2.3 各組小鼠血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平的比較

與Sham組比較，TCP組小鼠血清中T-AOC含量和SOD活性明顯降低，分別減少54.5%和42.2%(P<0.05)；與TCP組比較，NAC小鼠血清T-AOC含量和SOD活性明顯升高，分別是TCP組的2.21倍和1.34倍(P<0.05，圖2)，提示NAC可抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.4 各組小鼠假體周圍骨組織PERK/eIF2α信號通路活化

與Sham組比較，TCP組假體周圍發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，PERK/eIF2α信號通路被激活，表現(xiàn)為TCP組小鼠顱骨組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白質(zhì)GRP78、p-PERK和p-eIF2α水平均明顯增加(P<0.05)，p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α值明顯升高。與TCP組比較，NAC組小鼠顱骨組織中GRP78蛋白質(zhì)表達(dá)、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α值明顯降低(P<0.05，圖3)，表明NAC可抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及PERK/eIF2α通路的活化。

Fig.1Periprosthetic osteolysis induced by TCP wear particles in the mouse calvaria (n=12)

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group

A: T-AOC level; B: SOD activity. T-AOC: Total antioxidation capacity; SOD: Superoxide dismutase; TCP: Tricalcium phosphate; NAC: N-acetyl-L-cysteine

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group

Fig.3The protein expression of ER stress pathway in the mice calvaria (n=12)

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group

3 討論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體自由基、ROS產(chǎn)生過多或機(jī)體抗氧化能力減弱，ROS清除不足，體內(nèi)ROS蓄積超出了機(jī)體的清除能力，導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡而造成細(xì)胞和組織氧化損傷的病理過程。有研究表明，松動假體周圍組織中ROS水平較高，大量的ROS攻擊假體周圍組織細(xì)胞后引起GSH和MDA含量增加，改變細(xì)胞膜通透性進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)和假體周圍骨溶解[6-8]。與之類似，本研究結(jié)果顯示，TCP組小鼠血清T-AOC含量和SOD活性明顯下降，抗氧化劑NAC能明顯減輕TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的炎性因子的釋放和假體周圍骨溶解，與Fang等[11]報(bào)道的NAC阻止PE顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解的結(jié)果一致。以上研究結(jié)果提示，氧化應(yīng)激參與調(diào)控磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解。既往研究表明，氧化應(yīng)激能通過耗竭抗氧化物質(zhì)而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，間接促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、存活而影響骨吸收[12-15]。本研究中TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的激活有關(guān)，目前尚不清楚。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成、翻譯后修飾和折疊組裝的重要細(xì)胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)是指缺氧、饑餓、鈣平衡紊亂、自由基侵襲及藥物等刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)未折疊蛋白質(zhì)堆積，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被打破的病理性應(yīng)激狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控包含PERK/eIF2α、1型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)膜蛋白激酶α(inositol-requiring enzyme1α，IRE1α)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)三條信號通路[16,17]。其中，PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的感應(yīng)蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，PERK與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78解離并發(fā)生自身磷酸化，磷酸化的PERK使其下游eIF2α磷酸化而抑制蛋白質(zhì)合成，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能而促進(jìn)細(xì)胞存活[16]。因此，常以p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比值的變化反映PERK/eIF2α通路的活化情況。近年來，Wang等[18]和Liu等[19]報(bào)道，CoCrMo和TiAl6V4等磨損顆粒能激活I(lǐng)RE1α和ATF6內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TCP磨損顆?？杉せ罴袤w周圍骨組織中PERK/eIF2α信號通路介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白質(zhì)GRP78表達(dá)、增加p-PERK/PERK和p-eIF2α/p-eIF2α比值(圖3)，與我們之前的報(bào)道一致[5]。這提示：在假體周圍骨溶解過程中磨損顆粒能激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的三條經(jīng)典信號通路，其應(yīng)答差異可能是由于磨損顆粒種類不同所致。

另外，黃建青等[20]研究顯示，NAC能抑制晚期糖化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的成骨樣細(xì)胞MG63中GRP78表達(dá)增加，減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的IL-6釋放而阻止骨溶解。本研究觀察到NAC能明顯減輕TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白質(zhì)GRP78上調(diào)及PERK/eIF2α通路活化，表明TCP磨損顆?？赡芡ㄟ^誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及PERK/eIF2α通路活化，最終造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路介導(dǎo)的假體周圍骨溶解。氧化應(yīng)激是否影響IRE1α和ATF6通路而調(diào)節(jié)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解，尚需深入探討。