蘇 敏， 柏友萍△， 宋威巍， 王 明， 沈瑞睿， 杜康健， 夏行權(quán)， 聶劉旺

(1. 安徽師范大學(xué)體育學(xué)院， 2. 安徽省生物資源保護和利用重點實驗室， 安徽師范大學(xué)， 蕪湖 241003)

我國人口基數(shù)大，隨著國人預(yù)期壽命的不斷增加，老年人口增長迅速。老年人隨著年齡的增長，新陳代謝能力逐漸降低，使得在相同能量攝入條件下老年肥胖的患病率逐年上升，導(dǎo)致肥胖相關(guān)疾病的發(fā)病率日益增加，嚴重危害老年人的健康。因此，老年肥胖是我國一個嚴重的問題。探討老年肥胖發(fā)病機制，預(yù)防和減輕老年肥胖，提高老年人群的生活質(zhì)量成為目前的一個研究熱點。脂肪細胞因子是由脂肪組織分泌的，直接或間接參與肥胖和肥胖相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展[1]。脂聯(lián)素(adiponectin)是脂肪細胞特異分泌的蛋白質(zhì)類激素，是目前發(fā)現(xiàn)的對人體有保護作用的脂肪細胞因子。脂聯(lián)素不僅具有降低胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、抗炎和抗動脈粥樣硬化等生物學(xué)作用，還與肥胖相關(guān)疾病有著密切的關(guān)系。

以往的研究已經(jīng)證實，運動是減肥的主要手段，但在減肥過程中運動對肥胖相關(guān)疾病，尤其是對肥胖導(dǎo)致的胰島素抵抗的干預(yù)機制目前尚不清楚。本實驗通過制定運動方案，探討運動對肥胖老年大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素基因mRNA表達和蛋白質(zhì)表達、血漿脂聯(lián)素濃度、胰島素抵抗及血糖的影響，為制定運動減肥、科學(xué)健身措施，以及預(yù)防老年人肥胖相關(guān)疾病的生理機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

脂聯(lián)素mRNA：引物合成(上海生工技術(shù)有限公司)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(M1705), GoTaq?qPCR Master Mix (A6002) 為Promega產(chǎn)品；Trizol (SN114)，Oligo dT15，Random prime，RNase Inhibitor (R0004)，100 bp DNA Ladder(SN124)，脂聯(lián)素蛋白質(zhì)表達測定用電泳緩沖液(25 mmol/L Tris，0.25 mol/L 甘氨酸，0.1% SDS)(SN343)，顯影液、定影液(SN340)，羊抗兔IgG-HRP(H+L) (SN134)，羊抗小鼠IgG-HRP(H+L) (SN135) 為Sunshinebio產(chǎn)品；PVDF膜(Millipore)；Supersignal West Pico Trial kit(Pierce/34079)；兔抗大鼠脂聯(lián)素抗體(Bioss/bs-0471R)；小鼠抗β-actin抗體(Boster/ BM0627)，PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas/SM0671)。脂聯(lián)素濃度和胰島素濃度測定用ELISA試劑盒 (美國TSZ公司，上海研域生科公司代理)；血糖試劑盒(北京利德曼生化股份有限公司)。電子秤(JM-A20001/中國)，臺式高速離心機(eppendorf/Centrifuge 5417)，高速冷凍離心機(力康生物醫(yī)療科技/Neofuge15R)，PCR儀(MJ research/PTC200)，熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(博日/line-gene K FQD-48A)，凝膠成像系統(tǒng)(江蘇捷達科技/JD801)，可見紫外分光光度計(日立/U-2001)，洗板機(Tecan Columbus Washer/瑞士)，酶標(biāo)儀(Tecan Sunrise/瑞士)，6跑道大鼠跑臺(Wi32812/北京)。

1.2 實驗動物

實驗動物為老年肥胖大鼠。選取雄性SD大鼠(n=50)，清潔級，鼠齡21 d。大鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d，測量其體重為(74.5±7.4) g，體長為(12.4±0.5) cm。根據(jù)體重?zé)o差異(P>0.05)原則，隨機分為對照組(n=12)、實驗組(n=32)與老年運動組(n=6)，構(gòu)建老年肥胖大鼠模型。對照組和老年運動組大鼠喂飼普通飼料(6.0%脂肪率)；實驗組根據(jù)青春期、壯年期和老年期分三個階段喂飼高脂飼料，第一階段(第4～10周)喂飼36.3%脂肪率飼料，第二階段(第31～32周)和第三階段(第56～60周)喂飼40.0%脂肪率飼料。老年肥胖大鼠建模成功的依據(jù)為：鼠齡60周，體重≥對照組體重120%[2]。60周后，非肥胖大鼠(對照組和老年運動組)體重為(758.7±45.6) g，根據(jù)肥胖標(biāo)準(zhǔn)，肥胖大鼠建模成功的體重≥910.5 g。實驗期間，大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)房的相對濕度為50%～70%，溫度20℃±2℃，每天光照12 h，每周測量一次體重。本次實驗用SD大鼠、大鼠飼料和墊料均購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，該項研究獲得安徽師范大學(xué)動物倫理學(xué)會的同意(20130225)，本實驗中對動物的處死采用麻醉方法，符合中華人民共和國頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[3]。

1.3 實驗分組

考慮到本實驗中對照組與老年運動組飼養(yǎng)方式相同，將其合并隨機選取12只大鼠，再隨機分為對照組(control group，C)和老年運動組(aged exercise group，AE)，n=6，體重分別為(766.4±39.3) g和(768.0±17.7) g。選擇老年肥胖大鼠12只，隨機分為2組(n=6)，肥胖對照組(obese control group，OC)和肥胖運動組(obese exercise group，OE)，體重分別為(952.6±69.7) g和(940.5±68.4) g，組間體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。運動干預(yù)期間，各組大鼠每天每只定量供給30 g喂普通飼料。實驗期間，大鼠死亡2只(C組與OC組各1只)。

1.4 運動方案

運動組大鼠第61周開始進行為期5 d，每天2～3次的適應(yīng)性跑臺練習(xí)。該運動方案設(shè)計以本實驗室前期研究中的大鼠運動方案為依據(jù)[4]。該運動處方方案為大鼠跑臺坡度為0°。運動處方：15 m/min×15 min為1組，共運動4組，組間休息5 min，1次/天，5次/周，每周二和周五休息，共持續(xù)8周。對照組不運動，安靜狀態(tài)下籠養(yǎng)。

1.5 采樣與測試

經(jīng)8周運動方案干預(yù)后，大鼠停止運動2 d。隨后禁食12 h，禁水6 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，剖腹取大鼠腹主動脈血液，立即抗凝分離血漿，部分血漿用于測定空腹血糖，部分血漿保存于-80 ℃冰箱待測定胰島素和脂聯(lián)素濃度。計算胰島素抵抗[IR=(G0×I0)/22.5，I0為空腹血漿胰島素含量(mU/L)，G0為空腹血糖濃度(mmol/L)[5]]。采集大鼠內(nèi)臟脂肪組織，取部分含血管少的脂肪立即置于Trizol中，待脂聯(lián)素mRNA表達測定；部分內(nèi)臟脂肪組織用鋁箔紙包裹，待脂聯(lián)素蛋白質(zhì)表達測定。樣本均保存于-80℃冰箱。

1.5.1 qRT- PCR測定各組大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達 脂聯(lián)素引物：上游GGGACAACAATGGACTCTATG，下游CTGTCGCCTGTTCTTT-GATTC；β-actin上游CTAGAGGGTGTCCGCAATG，下游CAGTGGGAAGGTGTAGTC-AGTC。

內(nèi)臟脂肪組織中總RNA：勻漿→相分離→RNA沉淀→RNA洗滌→RNA溶解。RT反應(yīng)以脂聯(lián)素mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR Green Realtime-PCR，PCR擴增：95℃ 2 min預(yù)變性，1個循環(huán)；95℃ 10 s變性，60℃ 1 min退火及延伸，40個循環(huán)。溶解曲線分析：溫度控制在60 ℃～95 ℃，溫度間隔0.3 ℃，時間5 s/次，脂聯(lián)素Tm值為79.5 ℃。閾值與Ct值由軟件自動得出，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，采用2-ΔCt法計算相對定量。

1.5.2 Western blot測定各組內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素蛋白表達 取20 μl稀釋好的上樣樣品至0.5 ml離心管中，加入4 μl 6×SDS上樣緩沖液。配制5%的聚丙烯酰胺濃縮膠電泳，進行轉(zhuǎn)膜。將切好的膜置于甲醇中活化15 s后，移至轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡，然后將凝膠上的脂聯(lián)素蛋白質(zhì)移至PVDF膜上，以250 mA電流轉(zhuǎn)移1.5 h。將含有脂聯(lián)素的膜用TBS移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。加封閉液將內(nèi)參一抗(1∶1 000稀釋)，兔抗(1∶500稀釋)、4℃孵育過夜，用TBST室溫下脫色搖床上清洗4次。同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液(1∶2 000)并與膜接觸，室溫下孵育1 h后，室溫下脫色搖床上用TBST清洗5次。將化學(xué)發(fā)光試劑與膜中的蛋白質(zhì)混合孵育，最后將膠片進行掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)和Image J2軟件分析目的條帶的凈吸光度值。

1.5.3 ELISA測定各組血漿脂聯(lián)素濃度 采用ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)的雙抗體夾心法測定樣本中脂聯(lián)素及胰島素濃度。在Excel表格中，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)為對應(yīng)的吸光度 (absorbance，A)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線。脂聯(lián)素標(biāo)準(zhǔn)品試劑測量值與實際測量值相關(guān)系數(shù)r=0.997，曲線方程為y=0.009x-0.018；胰島素標(biāo)準(zhǔn)品試劑測量值與實際測量值相關(guān)系數(shù)r=0.999，曲線方程為y=0.020x+0.008，把該方程代入Excel表中，得到相應(yīng)的濃度值，再乘以5則為樣本實際濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 運動后老年肥胖大鼠脂肪組織脂聯(lián)素mRNA和蛋白質(zhì)表達及血漿脂聯(lián)素濃度的比較

脂聯(lián)素mRNA表達水平的比較：OC組顯著低于C組(P<0.01)，AE組顯著高于C組(P<0.01)；OE組顯著高于OC組(P<0.01)；OE組與AE組之間差異無顯著性(P>0.05，表1)。

脂聯(lián)素蛋白質(zhì)表達水平的比較：OC組顯著低于C組(P<0.01)，AE組顯著高于C組(P<0.01)；OE組顯著高于OC組(P<0.01)和AE組(P<0.01，圖1，表1)。

血漿脂聯(lián)素濃度比較：OC組、AE組與C組相比差異均無顯著性(P>0.05)；OE組顯著高于OC組與AE組(P<0.01，P<0.05，表1)。

GroupnAdiponectin mRNAAdiponectin proteinPlasma adiponectinconcentration(μg/L)C56.961±1.7481.284±0.01770.222±5.522OC54.243±0.575**1.069±0.072**64.444±3.239AE69.913±1.170**1.503±0.083**72.685±2.798OE610.644±2.090##1.729±0.058##△△79.722±4.169##△

C： Control group； OC： Obese control group； AE： Aged exercise group； OE： Obese exercise group

**P<0.01vsC group；##P<0.01vsOC group；△P<0.05,△△P<0.01vsAE group

Fig.1Comparison of adiponectin protein expression among the four groups after the experiment

2.2 運動后老年肥胖大鼠血糖和胰島素抵抗的比較

血糖濃度比較：OC組顯著高于C組(P<0.01)，AE組與C組之間差異無顯著性(P>0.05)；OE組顯著低于OC組(P<0.05)；OE組與AE組之間差異無顯著性(P>0.05，表2)。

胰島素抵抗比較：OC組顯著高于C組(P<0.01)，AE組與C組之間差異無顯著性(P>0.05)；OE組顯著低于OC組(P<0.01)；OE組與AE組之間差異無顯著性(P>0.05，表2)。

GroupnBlood glucose(mmol/L)Insulin resistanceC511.636±3.56815.880±4.272OC517.930±6.094**24.158±8.001**AE610.635±1.72116.964±4.858OE612.842±1.905#15.403±3.454##

C： Control group； OC： Obese control group； AE： Aged exercise group； OE： Obese exercise group

**P<0.01vsC group；#P<0.05,##P<0.01vsOC group

3 討論

脂聯(lián)素是一種由脂肪細胞分泌的蛋白質(zhì)類激素，在調(diào)節(jié)胰島素敏感性、葡萄糖和脂質(zhì)代謝方面起著重要作用，同時還具有抗炎和抗動脈粥樣硬化等特性[6]。有研究顯示[7]，BMI與血漿脂聯(lián)素濃度密切相關(guān)，13名肥胖但無疾病者與9名肥胖糖尿病患者在進食低能量飲食2個月后，隨著體質(zhì)量的下降，無論糖尿病患者還是非糖尿病患者，血漿脂聯(lián)素水平均顯著升高。另有研究表明，大網(wǎng)膜脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA的表達量隨著BMI的升高而下降，肥胖癥患者大網(wǎng)膜脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達水平顯著降低，這或許與肥胖者易患高血壓、糖尿病等疾病有關(guān)[8-9]。本實驗結(jié)果顯示，老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達和蛋白質(zhì)表達均明顯低于正常老年大鼠。

近年來，有關(guān)運動干預(yù)對脂聯(lián)素影響的研究越來越多。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，不同運動強度干預(yù)均能升高青春期肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達量，運動強度與表達量呈正相關(guān)[10]。陳斌等[11]實驗證實，6周的運動干預(yù)能顯著增強胰島素抵抗大鼠脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達，改善胰島素抵抗，說明運動或許通過增加脂聯(lián)素的表達來改善胰島素抵抗。吳衛(wèi)東等[12]研究顯示，14周有氧運動能顯著提高ApoE基因缺陷小鼠在動脈粥樣硬化形成過程中脂肪組織脂聯(lián)素mRNA的表達，抑制動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展。說明有氧運動對脂聯(lián)素mRNA的作用或許是運動防治動脈粥樣硬化的潛在機制。Kondo等[13]對肥胖女性進行有氧訓(xùn)練發(fā)現(xiàn)，訓(xùn)練前受試者脂聯(lián)素水平顯著下降，而7個月的有氧訓(xùn)練能顯著提高其脂聯(lián)素水平。Ryan等[14]對40名久坐不動的超重和肥胖女性進行有氧與抗阻運動訓(xùn)練，結(jié)果顯示6個月的訓(xùn)練顯著降低了體重、BMI、腰圍與臀圍，但血漿脂聯(lián)素水平卻無明顯變化。本實驗采用運動處方為15 m/min×15 min為1組，共運動4組，組間休息5 min，1次/天，5次/周，持續(xù)干預(yù)8周后發(fā)現(xiàn)，運動能明顯提高老年大鼠和老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達和蛋白質(zhì)表達，同時增加血漿脂聯(lián)素濃度。

有研究顯示，肥胖與胰島素抵抗密切相關(guān)，肥胖尤其腹部肥胖是引起胰島素抵抗的重要危險因素之一[15]。Lim等[16]研究顯示，每天60 min、每周3次、持續(xù)10周的有氧訓(xùn)練能有效升高中青年女性血漿脂聯(lián)素水平，同時伴隨著胰島素抵抗的降低。超重與肥胖增加胰島素抵抗，大大提高糖尿病發(fā)生的風(fēng)險，不同運動強度結(jié)合白藜蘆醇給藥可增加肥胖大鼠胰島素敏感性，降低空腹血糖[17]。姜繼權(quán)等[18]采用Meta分析發(fā)現(xiàn)，不同運動干預(yù)方式均可對糖尿病前期人群餐后2 h血糖和胰島素抵抗指數(shù)產(chǎn)生明顯影響，但對空腹血糖作用不顯著。羅曦娟等[19]研究證實，有氧或抗阻運動均可使糖尿病前期人群空腹血糖顯著下降，并在一定程度上使血糖下降至正常水平。劉敏[20]等研究發(fā)現(xiàn)，4周有氧運動訓(xùn)練能明顯改善肥胖青少年脂肪過度堆積狀況及胰島素抵抗，對肥胖青少年心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展具有一定的預(yù)防和延緩作用，同時還具有良好的抗炎效應(yīng)。許冬明等[21]實驗研究認為，血糖的下降可能是通過影響大鼠體內(nèi)脂聯(lián)素和瘦素的水平，調(diào)節(jié)脂肪代謝和胰島素分泌完成的。本實驗研究顯示，老年肥胖大鼠的胰島素抵抗和血糖濃度較自然生長老年大鼠明顯升高，而8周運動干預(yù)能有效改善胰島素抵抗，降低肥胖老年大鼠的血糖濃度，推測運動可能是通過升高脂聯(lián)素濃度來降低血糖，從而有利于防治糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。

總之，本研究表明，老年肥胖伴隨高血糖和胰島素抵抗、內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA和蛋白質(zhì)表達降低；對老年肥胖大鼠的運動干預(yù)能顯著增加內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達和蛋白質(zhì)表達，升高血漿脂聯(lián)素水平，改善胰島素抵抗，降低血糖。