張彥榮， 趙金濤， 郭新梅，2， 裴玉賀，2， 趙美愛， 宋希云，2

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護學(xué)院，山東青島 266109； 2.山東省青島市主要農(nóng)作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與應(yīng)用重點試驗室，山東青島 266109；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/植物生物技術(shù)重點試驗室，山東青島 266109)

直鏈淀粉具有非常獨特的利用價值，在輕工業(yè)、食品行業(yè)、制藥業(yè)等30多個領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。普通玉米籽粒中直鏈淀粉含量少，提取成本高，因此，新型玉米——高直鏈淀粉玉米應(yīng)運而生。高直鏈淀粉玉米胚乳中直鏈淀粉占總淀粉含量的50%以上，普通玉米中直鏈淀粉只占25%左右，而糯玉米中幾乎不含直鏈淀粉。為了探究不同類型玉米中淀粉含量差異的原因，科學(xué)家們做了大量關(guān)于淀粉生物合成及積累方面的研究。

研究發(fā)現(xiàn)，多種酶[包括蔗糖合成酶(SS)[1]、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADPGPPase)[2-4]、可溶性淀粉合成酶(SSS)[5]、束縛態(tài)淀粉合成酶(GBSS)[6-10]、淀粉分支酶(SBE)[11-12]、淀粉去分支酶(DBE)[13-14]等]參與了淀粉合成過程。關(guān)于各種酶在淀粉合成過程中發(fā)揮的作用，前人已做了較深入的研究，但是關(guān)于高直鏈淀粉玉米和糯玉米在籽粒發(fā)育過程中淀粉合成相關(guān)酶活性變化的研究卻鮮有報道。由于糯玉米胚乳中幾乎不含直鏈淀粉，而高直鏈淀粉玉米籽粒中直鏈淀粉含量高達(dá)50%以上，因此，在本研究中選取1個糯玉米自交系和3個高直鏈淀粉玉米自交系為材料，比較和分析2種玉米籽粒發(fā)育時期淀粉相關(guān)酶活性的變化，分析不同類型玉米之間直鏈淀粉含量差異的生理生化機制，為高直鏈淀粉玉米新品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用的糯玉米自交系為黑478，選用的高直鏈玉米自交系為NS39、B19-1、B26-5，4種玉米中直鏈淀粉含量分別為2.6%、51.8%、60.7%、62.7%。2014年將試驗材料種植于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代科技示范園，常規(guī)田間管理。選生長發(fā)育一致的植株，開花期人工授粉。自授粉之日起，每5 d取果穗中部籽粒，液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆?，共?次。

1.2 酶活性的測定

參照程方民等的方法[15]：取0.5 g籽粒鮮樣加5 mL提取液[終濃度為：Hepes-NaOH(pH值7.5)50 mmol/L，KCl 2 mmol/L，EDTA 5 mmol/L，PVP-30為10 g/L，DTT 1 mmol/L]，冰浴，磨成勻漿后取30 μL勻漿并加1.8 mL緩沖液，4 ℃、3 000 r/min 離心3 min，沉淀用緩沖液懸浮，用于GBSS活性的測定。其余勻漿4 ℃、13 000 r/min離心20 min，取上清液用于淀粉合成相關(guān)酶活性的測定。SS和ADPGPPase活性的測定參照Doehlert等的方法[16]。SSS、GBSS、SBE、DBE活性的測定參照Nakamura等的方法[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種玉米SS活性的變化

如圖1所示，4種玉米SS活性在籽粒發(fā)育時期呈單峰變化趨勢，授粉后20 d時SS活性達(dá)到峰值，而且4種玉米的峰值非常接近。授粉后15 d時，糯玉米黑478的SS活性比3種高直鏈玉米高，而在25～30 d時，黑478中SS活性低于高直鏈淀粉玉米。

2.2 4種玉米ADPGPPase活性的變化

如圖2所示，在籽粒發(fā)育過程中，糯玉米和高直鏈淀粉玉米中ADPGPPase的活性隨著籽粒成熟時間不斷升高。授粉后20～35 d，ADPGPPase的活性較穩(wěn)定，高直鏈玉米中ADPGPPase的活性顯著高于糯玉米黑478(P<0.05)，表明在籽粒灌漿后期，高直鏈玉米具有更高的ADPG供應(yīng)水平。

2.3 4種玉米SSS活性的變化

在玉米胚乳細(xì)胞中，SSS主要負(fù)責(zé)催化合成支鏈淀粉。如圖3所示，本試驗中糯玉米和高直鏈淀粉玉米SSS活性的變化趨勢相同，均為單峰曲線，不同的是，糯玉米黑478在授粉后20 d時達(dá)到峰值，而3種高直鏈玉米均在授粉后25 d時達(dá)到峰值。此外還發(fā)現(xiàn)，授粉15 d后，糯玉米黑478中SSS的活性一直高于3種高直鏈淀粉玉米。較低的SSS活性可能是高直鏈淀粉玉米中支鏈淀粉比例較少的影響因素之一。

2.4 4種玉米GBSS活性的變化

如圖4所示，GBSS活性在4個玉米自交系中均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。相比之下，糯玉米黑478更早達(dá)到峰值，GBSS活性在授粉后20 d時達(dá)到最大，而3個高直鏈淀粉玉米自交系中GBSS活性在授粉后25 d時達(dá)到最大值。高直鏈淀粉玉米GBSS活性在授粉25～35 d時明顯高于糯玉米黑478，表明高直鏈淀粉玉米在籽粒灌漿后期具有更強的直鏈淀粉合成能力。

2.5 4種玉米SBE活性的變化

如圖5所示，不同玉米中SBE活性均呈先上升后下降的變化趨勢。糯玉米黑478的SBE活性在授粉后20 d時達(dá)到最大值，3種高直鏈淀粉玉米中SBE在授粉后25 d達(dá)到最大值，而且?guī)缀踉谡麄€籽粒發(fā)育時期，黑478的SBE活性均高于3種高直鏈淀粉玉米。在淀粉合成過程中，SBE能催化使淀粉含有α-1，6糖苷鍵鏈接的支鏈，一方面，這能使葡聚糖的分子量不斷增大，以便細(xì)胞容納更多的具有能量的物質(zhì)；另一方面，α-1，6糖苷鍵的導(dǎo)入使葡聚糖的非還原性末端增加，這有利于淀粉合成酶的催化反應(yīng)，使它們能在短時間內(nèi)催化合成更多的淀粉。

2.6 4種玉米DBE活性的變化

如圖6所示，4種玉米自交系籽粒發(fā)育時期DBE活性的變化趨勢相似，在授粉后5～30 d DBE活性逐漸上升，并且在30 d時達(dá)到最大，在30～35 d時DBE活性快速下降。此外，糯玉米黑478中DBE的活性在每個時期都高于3種高直鏈淀粉玉米。DBE在淀粉合成時主要負(fù)責(zé)對支鏈淀粉的修飾，因此，黑478中支鏈淀粉含量多可能是導(dǎo)致籽粒發(fā)育過程中DBE活性較高的原因。

3 討論與結(jié)論

玉米籽粒中70%以上的成分是淀粉，其中直鏈淀粉是由α-1，4糖苷鍵連接α-D-葡萄糖而形成的鏈狀分子，分子量約為105～106[18]。支鏈淀粉分子量比直鏈淀粉大，大約由600～6 000個葡萄糖殘基構(gòu)成，在支鏈淀粉中，葡萄糖殘基除了以α-1，4糖苷鍵相連，還有以α-1，6糖苷鍵相連的分支。

玉米籽粒發(fā)育過程中淀粉的合成及積累是一個非常復(fù)雜的過程，包括多種碳水化合物的相互轉(zhuǎn)化，并且多種酶參與了這一過程。張海艷等報道，淀粉積累是蔗糖降解的結(jié)果，SS主要負(fù)責(zé)籽粒中蔗糖的降解，因此在蔗糖向淀粉的轉(zhuǎn)化過程中起重要作用[19]。本試驗中，糯玉米黑478在授粉后 15 d 時，籽粒中SS的活性比高直鏈淀粉玉米中高，在授粉后25～30 d時籽粒中SS的活性比高直鏈淀粉玉米中低，由此推測，相比糯玉米，高直鏈淀粉玉米在籽粒發(fā)育后期蔗糖分解旺盛，更有利于胚乳中淀粉的積累。

ADPGPPase的主要功能是催化淀粉合成時葡萄糖的供體ADPG的形成[16]，被普遍認(rèn)為是淀粉生物合成過程中的限速酶。但是，目前的研究對于ADPGPPase與淀粉合成之間關(guān)系的論述并不統(tǒng)一。部分研究表明，ADPGPPase的變化與淀粉含量之間呈正相關(guān)[2-3]，而另有研究表明，ADPGPPase活性的變化只能影響ADPG含量的變化，與最終淀粉含量的多少并無顯著關(guān)聯(lián)[19-20]。本試驗中，高直鏈淀粉玉米中ADPGPPase活性在大部分時期均顯著高于糯玉米，但是3種高直鏈淀粉玉米成熟籽粒的百粒質(zhì)量卻低于糯玉米黑478，因此，ADPGPPase活性的變化可能與籽粒中淀粉的合成并無簡單直接的相關(guān)性，籽粒中用于淀粉合成的葡萄糖可能有多種供應(yīng)途徑，并不單一依賴于ADPG的轉(zhuǎn)化。

SSS是催化淀粉合成的關(guān)鍵酶之一，同時也是催化支鏈淀粉合成的重要酶之一[21]。本試驗中，在授粉5～15 d時，4種玉米自交系中SSS的活性沒有明顯差異，在授粉后15～35 d 時，糯玉米黑478中SSS的活性明顯高于3種高直鏈淀粉玉米。高直鏈淀粉玉米中SSS活性較低可能是導(dǎo)致支鏈淀粉含量較少的原因之一。

GBSS對直鏈淀粉的合成起重要作用。本試驗中，GBSS的活性在糯玉米和高直鏈淀粉玉米中的差異主要出現(xiàn)在籽粒發(fā)育后期，在授粉后25～35 d時，3種高直鏈淀粉玉米中GBSS的活性均高于糯玉米黑478，說明高直鏈淀粉玉米在籽粒發(fā)育過程中直鏈淀粉的合成能力更強。劉霞等報道，籽粒灌漿中后期的GBSS活性對直鏈淀粉最終積累量的調(diào)節(jié)作用大于前期[22]，這也與此研究結(jié)果一致。

在植物淀粉合成過程中，SBE是唯一能引入α-1，6糖苷鍵而引起淀粉分支的酶，因此，其活性對支鏈淀粉的含量及精細(xì)結(jié)構(gòu)的影響非常重大。柴曉杰等應(yīng)用反義RNA和RNAi技術(shù)，抑制了玉米淀粉分支酶同工酶基因的表達(dá)，使支鏈淀粉的合成降低，直鏈淀粉的含量約提高50%[23]。本試驗中，在籽粒發(fā)育大部分時期糯玉米黑478 SBE的活性均高于3種高直鏈淀粉玉米，說明SBE活性與支鏈淀粉的積累緊密相關(guān)，這與前人的研究結(jié)果[11]是一致的。

有研究表明，玉米和水稻的Sugary-1突變體(缺失DBE活性)胚乳中水溶性多糖和植物糖原積累增多，支鏈淀粉積累減少，支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致淀粉的形態(tài)學(xué)和理化特性也發(fā)生了變化[13-14]。本試驗中，DBE在糯玉米黑478中的活性幾乎在整個籽粒發(fā)育時期都高于3種高直鏈淀粉玉米，這表明DBE活性似乎對支鏈淀粉的積累具有積極意義，結(jié)合前人的研究推測，DBE的作用可能主要是參與支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的修飾，其對于淀粉積累的作用還有待于更深入的研究。

通過比較分析糯玉米和高直鏈淀粉玉米在籽粒發(fā)育時期淀粉合成相關(guān)酶活性的變化，本研究認(rèn)為，SSS、GBSS、SBE等3種酶的活性是影響玉米籽粒直鏈淀粉含量或積累的重要影響因素，高直鏈淀粉玉米籽粒中直鏈淀粉含量高是上述3種酶綜合作用的結(jié)果。SS和ADPGPPase在淀粉合成過程中的主要作用是為淀粉合成提供底物，這2種酶的活性對籽粒最終總淀粉含量有一定影響。DBE在淀粉合成中的主要作用可能是對支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的修飾，與直鏈淀粉的積累沒有直接關(guān)系。由于本研究中只選取了1個糯玉米自交系及3個高直鏈淀粉玉米自交系，因此，試驗結(jié)果在高直鏈淀粉玉米和糯玉米中是否普遍適用還有待于進一步的探討。