朱勇良， 范方軍， 謝裕林， 伍應(yīng)保， 喬中英， 張建棟

(1.江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇蘇州 215155； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，江蘇南京 210014)

江蘇省太湖稻區(qū)以種植單季晚粳稻居多，近年來為了主動對接農(nóng)業(yè)供給側(cè)改革，對品種成熟期性狀的研究已拓展到遲熟中粳稻的選育和應(yīng)用方面，并且取得了較好的成效，如蘇香粳3號的審定和在適種地區(qū)作為特優(yōu)早熟品種的產(chǎn)業(yè)化配套應(yīng)用。由稻瘟病病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻的三大病害之一，對水稻持續(xù)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和品質(zhì)有重要的影響。稻瘟病在苗期和抽穗期均可發(fā)生，在抽穗期發(fā)病可導(dǎo)致白穗或半飽和穗，大大降低水稻產(chǎn)量，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致絕收。

水稻稻瘟病的抗性受多基因或數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus，簡稱QTL)控制，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和水稻基因組測序的完成，定位并克隆了一批抗稻瘟病基因。Pi-b基因是第1個(gè)通過圖位克隆得到的稻瘟病抗性基因，該基因位于水稻第2號染色體長臂末端[1-3]。Bryan等將水稻稻瘟病基因Pi-ta定位于水稻第12號染色體靠近著絲點(diǎn)附近的區(qū)域，并進(jìn)行了克隆[4]。稻瘟病抗病基因Pi54，最初被命名為Pi-kh，來源于水稻品種Tetep，與簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，簡稱SSR)標(biāo)記TRS26和TRS33緊密連鎖[5]。Xu等將稻瘟病基因Pi-kh精細(xì)定位在水稻第11號染色體上單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，簡稱SNP)標(biāo)記Kh45F～KhA3R之間的270 kb區(qū)間內(nèi)，PiQ-kh僅包含1個(gè)外顯子，編碼1個(gè)由330個(gè)氨基酸組成的含核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-亮氨酸重復(fù)序列(nucleotide binding site-leucine rich repeat，簡稱NBS-LRR)結(jié)構(gòu)的抗病蛋白[6]。

本研究選擇Pi-ta、Pi-b、Pi-kh/Pi54等抗病基因的功能標(biāo)記，檢測2016年遲熟中粳稻預(yù)備試驗(yàn)95份試驗(yàn)材料，結(jié)合苗瘟和穗頸瘟人工接種鑒定，對抗病基因進(jìn)行抗病性評價(jià)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為2016年江蘇省遲熟中粳稻預(yù)備試驗(yàn)新品系，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院遲熟中粳稻預(yù)備試驗(yàn)鑒定點(diǎn)提供，共95份。

1.2 DNA提取

采用十二烷基苯磺酸鈉法提取水稻基因組DNA。以基因組DNA為模板，按下列反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系(20 μL)含2.0 μL模板DNA(約15 ng/L)、2.0 μL引物(4 pmol/L)、2.0 μL 10×Buffer(25 mmol/L)、1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)、0.4 μL dNTP(2.5 mmol/L)、0.2 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、12.2 μL滅菌雙蒸水。在Biometra PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用溴化乙錠染色，在紫外凝膠成像儀上觀察并照相。

1.3 稻瘟病抗性鑒定方法

稻瘟病抗性鑒定的供試菌株為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所2015年分離得到的江蘇省稻瘟病病菌代表菌株，分別為ZB7、ZC11、ZD5、ZE3、ZF1、ZG1，并由植物保護(hù)研究所進(jìn)行接種鑒定。水稻苗瘟抗性鑒定采用苗期噴霧法進(jìn)行接種，每個(gè)處理3次重復(fù)。苗瘟抗性分為6級，0級為免疫，1級為高抗，2級為抗病，3級為中抗，4級為感病，5級為高感。

水稻穗頸瘟的抗性鑒定采用上述稻瘟病病菌菌株孢子的混合液在水稻孕穗初期進(jìn)行注射接種。在水稻成熟后進(jìn)行水稻穗頸瘟的抗性調(diào)查。穗頸瘟抗性分為6級，0級為無病，1級為抗病，3級為中抗，5級為中感，7級為感，9級為高感。

1.4 稻瘟病基因功能標(biāo)記的檢測

根據(jù)等位基因特異PCR原理，針對Pi-ta、Pi-b、Pi-kh/Pi54抗感等位基因序列差異設(shè)計(jì)引物(表1)，利用這些功能標(biāo)記檢測試驗(yàn)材料。利用Pi-ta引物檢測到1 042 bp片段，同時(shí)NPi-ta引物擴(kuò)增不出目的片段，這樣的材料含有Pi-ta基因[7]；利用Pi-b引物檢測到365 bp片段，同時(shí)NPi-b引物擴(kuò)增不出目的片段，這樣的材料含有Pi-b基因，而Pi-b基因不能擴(kuò)增出目的片段，但NPi-b引物擴(kuò)增出 803 bp 片段的材料攜帶有感病基因[2]；抗病基因Pi-kh功能標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，擴(kuò)增片段大小為216 bp(抗)/359 bp(感)[8]。

表1 用于PCR反應(yīng)的引物名稱、序列及預(yù)期片段長度

2 結(jié)果與分析

2.1 抗稻瘟病基因功能標(biāo)記檢測

利用抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi-kh標(biāo)記檢測95份試驗(yàn)材料，由表2可知，檢測到攜帶Pi-ta抗病基因的材料有59份(部分結(jié)果見圖1)，攜帶Pi-b抗病基因的材料有74份，攜帶Pi-kh抗病基因的材料有85份。檢測到僅攜帶Pi-ta、Pi-b、Pi-kh基因的材料分別有1、3、3份，同時(shí)攜帶Pi-ta、Pi-b基因的材料有5份，同時(shí)攜帶Pi-ta、Pi-kh基因的材料有16份(1份Pi-ta檢測為雜合)，同時(shí)攜帶Pi-b、Pi-kh基因的材料有29份，3個(gè)基因都攜帶的材料有37份，3個(gè)基因都不攜帶的材料有1份。

表2 供試材料抗病基因的分布及與苗瘟抗性等級的相關(guān)性

注：“no”表示不含抗病基因。表4同。

2.2 水稻苗瘟的抗性鑒定

由表2可知，苗瘟等級為0級的材料有3份，苗瘟等級為1級的材料有44份，苗瘟等級為2級的材料有30份，苗瘟等級為3級的材料有13份，苗瘟等級為4級的材料有4份，苗瘟等級為5級的材料有1份。攜帶抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi-kh的水稻品種，其苗瘟抗性等級絕大部分都在中抗及以上，但同時(shí)攜帶抗病基因Pi-ta、Pi-kh的水稻品種，苗瘟抗性更高，大部分品種都達(dá)到高抗及以上水平，但也有1個(gè)品種同時(shí)攜帶抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi-kh，苗瘟抗性等級為高感。

2.3 水稻穗頸瘟的抗性鑒定

由表3可知，在水稻孕穗初期人工接種鑒定穗頸瘟抗性等級為0、1級的材料均有0份，為3級的材料有7份，為5級的材料有51份，為7級的材料有35份，為9級的材料有2份。

表3 95份材料苗瘟、穗頸瘟人工鑒定與分子標(biāo)記檢測結(jié)果

注：“+”表示攜帶抗病基因；“-”表示攜帶感病基因。

2.4 抗稻瘟病基因與穗頸瘟抗性的關(guān)系

由表4可知，攜帶Pi-ta抗病基因的材料有59份，攜帶Pi-b基因的材料有74份，攜帶Pi-kh基因的材料有85份。不攜帶這3個(gè)抗病基因的材料有1份，它的稻瘟病抗病等級為7級。只攜帶其中1個(gè)抗病基因的材料有7份，其中稻瘟病抗病等級為5級的材料有3份，為7級的材料有4份；攜帶2個(gè)基因的材料有50份，其中稻瘟病抗病等級為3級的材料有4份，為5級的材料有25份，為7級的材料有19份，為9級的材料有2份；攜帶3個(gè)抗病基因的材料有37份，其中稻瘟病抗病等級為3級的材料有3份，為5級的材料有23份，為7級的材料有11份，為9級的材料有0份。該結(jié)果表明，只攜帶1個(gè)抗病基因或不攜帶抗病基因的材料其抗性都為5級或以上，且大部分都在7級或以上，攜帶2個(gè)或3個(gè)抗病基因的材料其抗性等級可達(dá)到3級，且大部分材料的抗性等級為5級。同時(shí)攜帶稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi-kh的材料有37份，其中3份穗頸瘟為中抗，其余為感病，表明聚合這3個(gè)基因的材料穗頸瘟表現(xiàn)既有抗病也有感病，說明這些材料的抗性不是由這3個(gè)基因互作產(chǎn)生的，須要進(jìn)一步挖掘這些材料的抗病基因，并應(yīng)用于穗頸瘟的抗病育種研究中。

表4 供試材料抗病基因的分布及與穗頸瘟抗性等級的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的水稻抗病育種一般通過雜交、回交、復(fù)交等方法，這種育種方法既耗時(shí)又耗力。分子標(biāo)記輔助選擇是結(jié)合生物技術(shù)的一種新型育種方法，主要利用與目的基因緊密連鎖或基因本身的分子標(biāo)記選擇基因型，不受水稻生育期和環(huán)境的影響，但一般是連鎖標(biāo)記，有時(shí)達(dá)不到選擇效果。

水稻抗病育種一直是育種家的重點(diǎn)研究內(nèi)容之一，特別是稻瘟病的抗病育種[9-11]。隨著一大批水稻稻瘟病基因的定位與克隆，開發(fā)了一批稻瘟病基因功能標(biāo)記。本研究利用Pi-b、Pi-ta、Pi-kh功能標(biāo)記對2016年遲熟中粳稻預(yù)備試驗(yàn)95份材料進(jìn)行抗病基因檢測，攜帶Pi-b、Pi-ta、Pi-kh抗病基因的品種，其苗瘟抗性等級基本達(dá)到中抗水平，同時(shí)攜帶Pi-ta、Pi-kh抗病基因的大部分品種抗性穗頸瘟達(dá)到5級，表現(xiàn)為中感。分別攜帶Pi-b和Pi-ta、Pi-b和Pi-kh的品種，穗頸瘟表現(xiàn)為中感、感病或高感。同時(shí)攜帶Pi-b、Pi-ta、Pi-kh抗病基因的品種有1份苗瘟抗性等級為5級，其穗頸瘟抗性等級達(dá)到7級，另外還有6份材料苗瘟為1級(高抗)，但穗頸瘟達(dá)到7級，苗瘟和穗頸瘟抗性表現(xiàn)不一致，表明苗瘟和穗頸瘟抗性控制可能不一致。攜帶有3個(gè)抗病基因的材料有37份，稻瘟病抗性綜合指數(shù)﹥5.00的材料有12份，達(dá)不到江蘇品種審定標(biāo)準(zhǔn)，這與范方軍等的研究結(jié)果[12]不一致，表明隨著江蘇省稻瘟病生理小種的進(jìn)化，稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi-kh的抗性正在喪失，亟須進(jìn)一步挖掘利用其他抗病基因。