圣 波，胡澤平，郭 影，顧奕玥，王云飛，周 青，汪 淵

肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)是間質(zhì)細(xì)胞趨化的多功能生長因子，可作用于多種類型的細(xì)胞，在細(xì)胞增殖、運動與遷移、抗凋亡、抗纖維化和調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[1]。最近研究[2]表明：HGF具有很強的抗炎作用，增加其表達(dá)可能有抗動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)作用。AS是發(fā)生在動脈血管壁的慢性炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)是其突出的促發(fā)因素。其中，巨噬細(xì)胞扮演著重要角色[3]。巨噬細(xì)胞根據(jù)激活方式的不同，可分為經(jīng)典活化的M1型和替代活化的M2型。M1型巨噬細(xì)胞具有促炎作用，增加易損斑塊的不穩(wěn)定性，加速AS進程；M2型巨噬細(xì)胞具有抗炎作用，促進組織修復(fù)與血管形成，延緩AS進程。在AS中，兩者之間的比例顯著影響斑塊的結(jié)局。本課題組前期研究[4]已表明，在AS兔模型中，HGF通過抑制M1型巨噬細(xì)胞浸潤、誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞分化而促進斑塊穩(wěn)定，抑制AS進展。然而，體外條件下，HGF能否調(diào)控巨噬細(xì)胞極化至今尚未見報道。該研究探討體外條件下，HGF對巨噬細(xì)胞M1、M2型極化的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 RAW264.7細(xì)胞株為小鼠來源的巨噬細(xì)胞株，由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院饋贈。

1.1.2主要試劑和儀器 HGF、白介素-4(interleukin-4, IL-4)和干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)購自美國Peprotech公司；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)、細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)及3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基(高糖)購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；青霉素、鏈霉素購自華北制藥華勝公司；兔誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)多抗購自美國Abcam公司；兔精氨酸酶II(arginase II, Arg II) 多抗、兔精氨酸酶I(arginase I, Arg I)多抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；β-actin 單抗購于美國Santa Cruz公司；相應(yīng)二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；免疫熒光試劑盒購自碧云天公司；白介素-6(interleukin-6, IL-6)、白介素-10(interleukin-10, IL-10)ELISA試劑盒購自北京四正柏科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖完全培養(yǎng)基中(10%胎牛血清、100 μg/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶置入飽和濕度、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%融合并處于對數(shù)生長期時，PBS清洗3次后，0.25%胰酶進行1 ∶3消化傳代。

1.2.2體外誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞極化 待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，細(xì)胞換液后，用含IFN-γ(20 ng/ml)和LPS(500 ng/ml)的DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)其向M1型極化；用含IL-4(20 ng/ml)的DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)其向M2型極化。

1.2.3實驗分組 實驗分為5組。細(xì)胞對照組：即Mφ型巨噬細(xì)胞；空白對照組：即M1、M2型巨噬細(xì)胞；用藥組：分別給予0.1、1.0、10.0 ng/ml的HGF對M1、M2型巨噬細(xì)胞進行處理12 h。

1.2.4MTT試驗 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞懸液以200 μl/孔(2×103個細(xì)胞)接種于96孔板中，置于飽和濕度、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，吸棄上清液，換成含不同濃度的HGF完全培養(yǎng)基，HGF的濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0 ng/ml；培養(yǎng)12 h后，每孔加入20 μl MTT繼續(xù)孵育4 h，棄MTT上清液，添加200 μl DMSO并置于平板床上低速震動10 min，待結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)儀上測定450 nm波長處的吸光度值。同樣的方法分別測定M1、M2型巨噬細(xì)胞在HGF濃度為0.1、1.0、10.0 ng/ ml時的吸光度值。

1.2.5Western blot法檢測Arg II、Arg I的蛋白表達(dá) 按上述方法進行細(xì)胞培養(yǎng)及極化，在誘導(dǎo)12 h后，分別加入0.1、1.0、10.0 ng/ml的HGF處理細(xì)胞，同時設(shè)立細(xì)胞對照組與空白對照組，共培養(yǎng)24 h，每孔加入80 μl蛋白裂解液，冰上靜置30 min，充分裂解后提取蛋白，反復(fù)凍融3次，于4 ℃、14 000 r/min離心30 min后采用BCA法進行蛋白定量。12.5%SDS聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，50 V濃縮膠，100 V分離膠，電泳分離細(xì)胞蛋白質(zhì)，160 mA將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，孵育相應(yīng)一抗Arg Ⅱ(1 ∶200)、Arg I(1 ∶200)4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，室溫孵育二抗2 h，TBST洗滌3次后用ECL進行顯影及曝光，以β-actin為內(nèi)參，用Quantity One系統(tǒng)進行灰度值分析。

1.2.6細(xì)胞免疫熒光法檢測iNOS、Arg I的表達(dá) 將蓋玻片置于12孔板中，種入RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)過夜，按上述極化方法及實驗分組培養(yǎng)細(xì)胞，共培養(yǎng)24 h，取出蓋玻片，PBS清洗，在37 ℃條件下用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS清洗后，0.3%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)透化細(xì)胞膜5 min，TBS清洗1次后改用PBS清洗2次，封閉液(含5%BSA及0.1% TritonX-100)封閉細(xì)胞60 min，去封閉液，加入iNOS和Arg I一抗(均1 ∶150)，4 ℃孵育過夜，次日去除一抗，TBS清洗1次，PBS清洗2次，每次5 min，加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗(1 ∶1 000)，室溫避光孵育60 min，TBS清洗1次，PBS清洗2次， DAPI(0.5 μg/ml)染核10 min，棄DAPI，PBS清洗3次，抗熒光淬滅封片液進行封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并采集圖片。

1.2.7ELISA法檢測細(xì)胞上清液中IL-6、IL-10的濃度 取各組培養(yǎng)上清液進行實驗，根據(jù)IL-6、IL-10的ELISA 試劑盒說明書進行操作，檢測上清液中表達(dá)水平，酶標(biāo)儀檢測吸光度值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。

2 結(jié)果

2.1HGF對RAW264.7及M1、M2型巨噬細(xì)胞增殖的影響HGF濃度在0.1～10.0 ng/ml范圍內(nèi)對RAW264.7巨噬細(xì)胞無增殖作用(F=0.720，P=0.770)(表1)；當(dāng)HGF濃度分別為0.1、1.0、10.0 ng/ml時，對M1及M2型巨噬細(xì)胞均無增殖作用(F=1.238，P=0.323；F=0.469，P=0.707)(表2)；結(jié)果提示本實驗采取的藥物濃度梯度對后續(xù)實驗無影響。

2.2HGF對M1型巨噬細(xì)胞極化的影響

組別濃度(ng/ml)吸光度值101.435±0.04720.11.301±0.09530.51.207±0.17941.01.278±0.12951.51.180±0.12062.01.160±0.35872.51.312±0.19083.01.129±0.07093.51.159±0.103104.01.173±0.027114.51.280±0.055125.01.226±0.253135.51.227±0.12414 6.01.143±0.108156.51.114±0.135167.01.215±0.359178.01.130±0.072189.01.288±0.1761910.01.153±0.067

濃度(ng/ml)吸光度值M1型M2型01.190±0.1261.054±0.1220.11.071±0.0471.055±0.1011.01.061±0.1871.019±0.06910.00.982±0.2180.993±0.131

2.2.1HGF對M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg II蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示：與Mφ組相比，M1組Arg II表達(dá)明顯增加(F=3.680，P<0.05)；與M1組相比，HGF各干預(yù)組Arg II表達(dá)明顯減少(F=183.472，P<0.05)。見圖1。

圖1 Western blot 法檢測Arg II蛋白表達(dá)

1：Mφ組；2：M1組；3：M1+0.1ng/ml HGF組；4：M1+1.0 ng/ml HGF組；5：M1+10.0 ng/ml HGF組;與Mφ組比較：*P<0.05；與M1組比較：#P<0.05

2.2.2HGF對M1型巨噬細(xì)胞胞內(nèi)iNOS蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示：與Mφ組相比，M1組iNOS表達(dá)明顯增加；與M1組相比，HGF各干預(yù)組iNOS表達(dá)明顯減少。見圖2。

2.2.3HGF對M1型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-6水平的影響 結(jié)果顯示：與Mφ組相比，M1組細(xì)胞上清液IL-6水平明顯增加(F=0.430，P<0.05)；與M1組相比，HGF各干預(yù)組細(xì)胞上清液IL-6水平明顯減少(F=30.367，P<0.05)。見圖3。

2.3HGF對M2型巨噬細(xì)胞極化的影響

2.3.1HGF對M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg I蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示：與Mφ組相比，M2組Arg I表達(dá)明顯上升(F=0.920，P<0.05)；與M2組相比，HGF各干預(yù)組Arg I表達(dá)明顯上升(F=1.338，P<0.05)，且1.0、10.0 ng/ml HGF處理組呈劑量依賴性(F=0.182，P<0.01)。見圖4。

圖2 細(xì)胞免疫熒光法檢測iNOS蛋白表達(dá) ×400

A：Mφ組iNOS表達(dá)；B：Mφ組細(xì)胞核染色；C：A、B合成圖；D：M1組iNOS表達(dá)；E：M1組細(xì)胞核染色；F：D、E合成圖；G：M1+0.1ng/ml HGF組iNOS表達(dá)；H：M1+0.1ng/ml HGF組細(xì)胞核染色；I：G、H合成圖；J：M1+1.0 ng/ml HGF組iNOS表達(dá)；K：M1+1.0 ng/ml HGF組細(xì)胞核染色；L：J、K合成圖；M：M1+10.0 ng/ml HGF組iNOS表達(dá)；N：M1+10.0 ng/ml HGF組細(xì)胞核染色；O：M、N合成圖

圖3 ELISA法檢測細(xì)胞上清液IL-6濃度

1：Mφ組；2：M1組；3：M1+0.1 ng/ml HGF組；4：M1+1.0 ng/ml HGF組；5：M1+10.0 ng/ml HGF組;與Mφ組比較：*P<0.05；與M1組比較：#P<0.05

2.3.2HGF對M2型巨噬細(xì)胞胞內(nèi)Arg I蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示：與Mφ組相比，M2組Arg I表達(dá)明顯上升；與M2組相比，HGF各干預(yù)組Arg I表達(dá)明顯上升。見圖5。

2.3.3HGF對M2型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-10水平的影響 結(jié)果顯示：與Mφ組相比，M2組IL-10表達(dá)水平上升(F=1.226，P<0.05)；與M2組相比，HGF各干預(yù)組IL-10表達(dá)水平明顯上升(F=90.437，P<0.05)，且1.0、10.0 ng/ml HGF處理組呈劑量依賴性(F=0.276，P<0.01)。見圖6。

圖4 Western blot 法檢測Arg I蛋白表達(dá)

1：Mφ組；2：M2組；3：M2+0.1 ng/ml HGF組；4：M2+1.0 ng/ml HGF組；5：M2+10.0 ng/ml HGF組；與Mφ組比較：*P<0.05；與M2組比較：#P<0.05

3 討論

以AS為病理基礎(chǔ)的心腦血管疾病逐年遞增，防治任務(wù)艱巨。AS的發(fā)生、發(fā)展是一個慢性炎癥過程，巨噬細(xì)胞作為最具代表性的炎癥細(xì)胞，其通過吞噬氧化修飾的脂質(zhì)、凋亡細(xì)胞碎片，分泌炎癥因子、金屬蛋白酶等途徑介導(dǎo)炎癥過程[5]。由于巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性及可塑性的特點，在AS發(fā)生、發(fā)展過程中，其可隨局部微環(huán)境的改變而表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài)，M1、M2型正是該狀態(tài)的兩個極端。M1型巨噬細(xì)胞通過分泌iNOS、白介素-12(interleukin-12, IL-12)、白介素-23(interleukin-12, IL-23)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等促炎因子，促進病灶內(nèi)的炎癥反應(yīng)；M2型巨噬細(xì)胞通過分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor α, TGF-β)等抗炎因子，促進纖維帽的形成及組織修復(fù)，抑制病灶內(nèi)的炎癥反應(yīng)[6]。因此，調(diào)控巨噬細(xì)胞極性可能成為臨床治療以AS為病理基礎(chǔ)的心腦血管疾病的新策略。

圖5 細(xì)胞免疫熒光法檢測Arg I蛋白表達(dá) ×400

A：Mφ組Arg I表達(dá)；B：Mφ組細(xì)胞核染色；C：A、B合成圖；D：M2組Arg I表達(dá)；E：M2組細(xì)胞核染色；F：D、E合成圖；G：M2+0.1 ng/ml HGF組Arg I表達(dá)；H：M2+0.1 ng/ml HGF組細(xì)胞核染色；I：G、H合成圖；J：M2+1.0 ng/ml HGF組Arg I表達(dá)；K：M2+1.0 ng/ml HGF組細(xì)胞核染色；L：J、K合成圖；M：M1+10.0 ng/ml HGF組Arg I表達(dá)；N：M2+10.0 ng/ml HGF組細(xì)胞核染色；O：M、N合成圖

圖6 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中IL-10濃度

1：Mφ組；2：M2組；3：M2+0.1 ng/ml HGF組；4：M2+1.0 ng/ml HGF組；5：M2+10.0 ng/ml HGF組；與Mφ組比較：*P<0.05；與M2組比較：#P<0.05

本研究采用小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，在體外條件下，以IFN-γ聯(lián)合LPS 誘導(dǎo)其向M1型極化，IL-4誘導(dǎo)其向 M2 型極化，誘導(dǎo)極化的同時加入不同濃度的HGF進行干預(yù)，探討體外條件下，HGF對M1、M2型巨噬細(xì)胞極化的影響。結(jié)果顯示：與Mφ組相比，M1組Arg II、iNOS、IL-6及M2組Arg I、IL-10的表達(dá)水平均明顯升高，提示造模成功。不同濃度的HGF干預(yù)后，與M1組相比，HGF各干預(yù)組Arg II、iNOS、IL-6的表達(dá)明顯降低；與M2組相比，HGF各干預(yù)組Arg I、IL-10的表達(dá)明顯升高；表明HGF抑制RAW264.7細(xì)胞向M1型極化，促進其向M2型極化。

目前研究已表明，他汀類[7]、噻唑烷二酮類[8]、替米沙坦[9]及中藥姜黃素[10]等能誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，而巨噬細(xì)胞的極化受多種信號通路及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[11]，目前比較明確的主要有：信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)、核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)、IFN調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor, IRF)、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ, PPAR-γ)、孤兒核受體、表觀遺傳調(diào)節(jié)等。不同微環(huán)境下，巨噬細(xì)胞亞型之間可相互轉(zhuǎn)化[12]，HGF通過何種機制抑制M1型極化而促進M2型極化，尚需進一步研究。

綜上所述，巨噬細(xì)胞M1、M2亞型比例失衡促進AS的發(fā)生和發(fā)展，HGF抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化、促進其向M2型極化，可能成為抗AS治療的新靶點。