劉小芳，陳谷，林詩琪，許白雪

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

隨著現(xiàn)代工業(yè)和農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，大量的污水排放以及肥料重施，造成廢水中氮的含量劇增。近幾十年來，我國地表水和地下水中氮的濃度不斷增加，例如 1980年到 2010年，我國每年的氮沉積量增加60%[1,2]。氮過量影響生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定和農(nóng)業(yè)效益，處理廢水成為重要的工作。微藻不但可以用于新型能源的開發(fā)，也可以應(yīng)用于處理工農(nóng)業(yè)廢水[3]。微藻可以利用廢水中各種形式的氮源，如銨鹽或硝酸根；但是微藻的生長對銨鹽濃度較敏感，處理廢水過程中過高濃度的銨會抑制微藻的生長。研究微藻在銨鹽中的生長，探索微生物適應(yīng)高濃度 NH4+/NH3的機(jī)制，將為未來提高微藻對銨鹽的耐受奠定基礎(chǔ)。研究擬南芥中EGY1突變導(dǎo)致的銨敏感突變株amso1對銨鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制，揭示參與銨脅迫響應(yīng)的基因中90%的基因調(diào)控都依賴于EGY1[4]。EGY1是擬南芥S2P蛋白酶編碼基因之一，故本研究探討集胞藻中的S2P蛋白酶基因sll0528是否參與集胞藻對銨鹽脅迫的響應(yīng)。

集胞藻PCC6803（Synechocystis sp. PCC6803）屬藍(lán)藻門色球藻目集胞藻屬，它通過二分裂方式增殖，培養(yǎng)周期短，既可光合自養(yǎng)、混養(yǎng)還可異養(yǎng)。類似綠色植物，集胞藻PCC6803有兩個光合作用系統(tǒng)，光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）。由于集胞藻PCC6803獨特的生理特征，以及測序完全等特點，已成為研究光合作用、脅迫響應(yīng)等的模式生物，也作為工程菌應(yīng)用于新型能源的開發(fā)[5,6]。S2P家族蛋白酶存在于從細(xì)菌到人類的多數(shù)物種，不同物種間的S2P蛋白酶都具有保守的催化基序[7]，S2P蛋白酶介導(dǎo)的調(diào)節(jié)膜內(nèi)蛋白水解機(jī)制被認(rèn)為是潛在的外界信號接收傳導(dǎo)機(jī)制。在大腸桿菌等原核細(xì)菌中，當(dāng)機(jī)體受到刺激時，S1P和S2P蛋白酶連續(xù)剪切抗σ因子，釋放EFCσ因子，EFCσ因子結(jié)合RNA聚合酶中心酶，轉(zhuǎn)錄表達(dá)相應(yīng)的蛋白以適應(yīng)刺激[8]。集胞藻PCC6803中有四個S2P蛋白酶 Sll0862、Slr0643、Sll0528、Slr1821。通過敲除基因slr0643并研究該缺失藻株Δslr0643，發(fā)現(xiàn)Slr0643參與酸脅迫響應(yīng)機(jī)制[9]?；騭ll0862的敲除導(dǎo)致缺失藻株Δsll0862在高溫和氧化脅迫響應(yīng)中表現(xiàn)出缺陷，說明Sll0862參與調(diào)控高溫和氧化脅迫響應(yīng)[10]。應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)（RT-qPCR）研究集胞藻基因sll0528在不同脅迫下的表達(dá)譜，以及對sll0528敲除的缺失藻株Δsll0528進(jìn)行各種脅迫響應(yīng)實驗，都表明Sll0528參與多種脅迫包括鹽、滲透壓、高光等[11,12]。而敲除slr1821的缺失藻株Δslr1821在熱脅迫響應(yīng)研究中揭示了 Slr1821對熱脅迫響應(yīng)機(jī)制起著重要作用[13]。

本研究構(gòu)建了集胞藻PCC6803基因sll0528在光誘導(dǎo)強(qiáng)啟動子-基因psbA2啟動子(PpsbA2)驅(qū)動下的過表達(dá)藻株 OE0528，并探究比較了不同氯化銨濃度條件下野生型（wild type，WT）、過表達(dá)藻株OE0528和缺失藻株Δsll0528的生理表型，初步揭示S2P蛋白酶Sll0528響應(yīng)NH4+的功能與機(jī)理，為后續(xù)深入探索微藻對NH4+脅迫響應(yīng)機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

實驗材料：質(zhì)粒 pUC118，質(zhì)粒 pET-30b(+)，大腸桿菌DH10B，限制性內(nèi)切酶，T4 DNA Ligase，Taq DNA聚合酶，Primer Star NDA聚合酶，硫酸卡那霉素，氯霉素，氨芐青霉素，BG11培養(yǎng)基（實驗室自配），HEPES，Na2S2SO3，三羥甲基甲胺基乙磺酸（TES），質(zhì)粒小量提取試劑盒，細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒，細(xì)菌/細(xì)胞RNA提取試劑盒，DNA純化回收試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，RT-qPCR試劑盒，氯化銨等。集胞藻PCC6803野生型，購自美國標(biāo)準(zhǔn)藻種庫。

主要儀器：PCR儀，核酸電泳儀，冷凍循環(huán)水浴鍋，干式恒溫器，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，臺式恒溫振蕩器，凝膠成像系統(tǒng)，高壓滅菌鍋，鼓風(fēng)烘箱，多功能組合搖床，生物安全柜，紫外分光光度計，小型臺式離心機(jī)，臺式冷凍離心機(jī)，移液槍等。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

圖1 重組質(zhì)粒p3031P0K構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of construction program for the recombinant plasmid p3031P0K

以集胞藻 PCC6803基因組 DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到slr2030和slr2031片斷，sll0528片段，和psbA2的啟動子片段，以pET-30b（+）為模板PCR擴(kuò)增得到抗卡那霉素（kmr）片段，引物見表1，引物作用位置見圖2?；騾⒖夹蛄衼碜訬CBI數(shù)據(jù)庫。將獲得的目的基因片段純化回收后利用限制性內(nèi)切酶剪切，同時用同樣的限制性內(nèi)切酶剪切載體質(zhì)粒pUC118，再用連接酶將目的基因片段和載體質(zhì)粒按順序一一連接起來，構(gòu)建重組質(zhì)粒 p3031P0K，重組質(zhì)粒p3031P0K構(gòu)建方案如圖1所示。構(gòu)建完成重組質(zhì)粒后通過PCR技術(shù)在DNA水平驗證目的基因片段是否插入質(zhì)粒。

1.2.2 同源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化集胞藻PCC6803

采用 Williams[14]的方法將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒p3031P0K通過同源臂slr2030和slr2031同源轉(zhuǎn)化進(jìn)入集胞藻PCC6803野生型。使過表達(dá)元件kmr+啟動子PpsbA2+sll0528插入到集胞藻基因slr2030和slr2031中間的中性位點，方案如圖2所示。得到轉(zhuǎn)化子后，將轉(zhuǎn)化子在含低濃度硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基上生長，待長出單藻落，轉(zhuǎn)移到含低濃度硫酸卡那霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按此方式逐步提高抗生素濃度并對過表達(dá)藻株傳代。期間不斷檢測DNA水平上的中性位點是否被替代，最終得到中性位點被替代的能穩(wěn)定遺傳的過表達(dá)藻株OE0528。進(jìn)而進(jìn)行基因sll0528表達(dá)水平的驗證。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.3 集胞藻PCC6803的培養(yǎng)方法

以O(shè)D730=0.1為起始濃度將集胞藻接入液體BG11培養(yǎng)基，在光照 25 μmol/(m2·s)，溫度 29 ℃，轉(zhuǎn)速 150 r/min搖床中連續(xù)培養(yǎng)5 d。液體BG11培養(yǎng)基中加入終濃度為0.02 M的HEPES。集胞藻藻落生長于固體BG11培養(yǎng)基中。固體BG11培養(yǎng)基加入濃度為0.02 M的HEPES，終濃度為0.3%的Na2S2SO3和終濃度為8 mM的TES。培養(yǎng)過程需加入相應(yīng)抗生素。

1.2.4 過表達(dá)藻株OE0528在DNA水平的鑒定

用試劑盒提取WT和過表達(dá)藻株OE0528的基因組DNA，用表1所示過表達(dá)藻株驗證用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增中性位點基因序列，或者是插入中性位點的片段，看產(chǎn)物電泳圖條帶位置與理論值是否一致，來判斷過表達(dá)元件是否進(jìn)入到集胞藻WT基因組相應(yīng)位置。

1.2.5 過表達(dá)藻株OE0528在RNA水平的驗證

用試劑盒分別提取WT和過表達(dá)藻株OE0528的RNA，用DNase去除RNA中殘留的DNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，以cDNA為模板用RT-qPCR驗證用引物（表1所示）進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，來驗證sll0528是否得到過表達(dá)。采用相對定量法，以 rnpB基因作為內(nèi)參。基因rnpB在集胞藻中負(fù)責(zé)編碼RNase P的亞基B，表達(dá)量恒定[15]。得到擴(kuò)增曲線后統(tǒng)一閾值線得出CT值，將參照基因與目的基因CT值相減得?CT值，目的基因表達(dá)量=2?CT，得到野生型WT和過表達(dá)藻株OE0528中sll0528相對表達(dá)量，歸一化后進(jìn)行比較。每個樣品做三個平行，每個平行4個重復(fù)。

1.2.6 集胞藻吸光度值和全細(xì)胞吸收值的測定

將WT和過表達(dá)藻株OE0528以O(shè)D730=0.1作為起始濃度接入液體BG11培養(yǎng)基中，控制脅迫條件，在光照 25 μmol/(m2·s)，溫度 29 ℃，轉(zhuǎn)速 150 r/min 搖床中連續(xù)培養(yǎng)5 d，每24 h取樣2 mL用紫外分光光度計測定730 nm處的吸光度值（A730/OD730）或進(jìn)行全波長掃描，得到數(shù)據(jù)繪制曲線。每個樣品做3個平行。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本文采用Origin Pro 8.5，SPSS 19.0等軟件處理分析實驗數(shù)據(jù)，得到集胞藻生長曲線圖和全細(xì)胞吸收圖，基因表達(dá)量柱狀圖等。實驗重復(fù)數(shù)均為 3次，n=3；圖中誤差線均表示實驗結(jié)果=均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）。顯著性檢驗采用單因素方差分析，與對照組做比較，“*”表示 p＜0.05 為顯著差異，“**”p＜0.01 為極顯著差異。

2 結(jié)果和討論

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

圖2 重組質(zhì)粒p3031P0K同源轉(zhuǎn)化入集胞藻示意圖Fig.2 Schematic diagram of recombinant plasmid p3031P0K homologous transformed into Synechocystis sp. PCC6803

圖3 重組質(zhì)粒鑒定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid

按圖1所示方案，構(gòu)建好重組質(zhì)粒p3031P0K，質(zhì)粒插入基因slr2030片段、kmr，強(qiáng)啟動子PpsbA2，基因sll0528和基因slr2031片斷。重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后采用PCR鑒定目的基因是否插入質(zhì)粒，所用引物與構(gòu)建時擴(kuò)增5段目的基因用引物相同，見表1，引物作用位置圖2所示。以重組質(zhì)粒和WT基因組分別作模板，擴(kuò)增基因slr2030片段、強(qiáng)啟動子PpsbA2、sll0528、基因slr2031片斷；再以重組質(zhì)粒和pET-30b（+）分別作模板，擴(kuò)增 kmr。產(chǎn)物電泳并分析比較，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中各個片段PCR產(chǎn)物與以WT基因組、PET-30b（+）作模板各個片段PCR產(chǎn)物電泳后條帶位置一致（圖3）。測定PCR產(chǎn)物序列并比對，結(jié)果相同，說明5個目的片段成功插入到載體質(zhì)粒pUC118。

2.2 過表達(dá)藻株OE0528的構(gòu)建與鑒定

2.2.1 DNA水平上鑒定

圖4 OE0528在DNA水平的鑒定Fig.4 Identification of the OE0528 at the DNA level

按圖2所示方案，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒p3031P0K轉(zhuǎn)化導(dǎo)入集胞藻PCC6803野生型基因組，通過同源重組雙交換，借助同源臂slr2030和slr2031，將過表達(dá)元件 kmr+啟動子 PpsbA2+sll0528插入到野生型基因組的slr2030和slr2031基因中間，以期達(dá)到過表達(dá)基因sll0528的目的?；騭lr2030和slr2031中間位置可以用于插入外源基因[16]，作為中性位點，故選這兩段基因作為同源臂。待篩選到sll0528過表達(dá)藻株OE0528后，提取過表達(dá)藻株DNA，用引物3031-2-L，3031-2-R和3031-1-L，3031-1-R（表1）PCR擴(kuò)增相應(yīng)片段，引物作用位置見圖2，在DNA水平驗證sll0528的過表達(dá)。結(jié)果見圖 4。通過不斷提高培養(yǎng)基中卡那霉素（Km）的濃度，最終篩選出6株獨立的sll0528過表達(dá)藻株OE0528。分別以野生型和6株過表達(dá)藻株基因組為模板，用引物3031-2-L，3031-2-R和3031-1-L，3031-1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。先以3031-2-L，3031-2-R為引物 PCR擴(kuò)增，野生型擴(kuò)增結(jié)果為 slr2030和slr2031部分片斷和基因間片斷，長度為1001 bp；當(dāng)過表達(dá)藻株中 kmr+啟動子 PpsbA2+sll0528三個片段完全插入到中性位點時，擴(kuò)增結(jié)果包括 kmr+啟動子PpsbA2+sll0528三個片段，長度為3350 bp；當(dāng)過表達(dá)藻株中三個片段未完全取代中性位點片段時，擴(kuò)增結(jié)果會出現(xiàn)3350 bp和1001 bp兩條條帶。如圖4A所示，野生型PCR擴(kuò)增條帶在1001 bp附近，OE0528-1、OE0528-2、OE0528-3、OE0528-4、OE0528-5 各過表達(dá)藻株P(guān)CR擴(kuò)增條帶在3350 bp附近，長度與理論值一致，初步說明sll0528過表達(dá)元件已完全插入5株藻株中。但是過表達(dá)藻株 OE0528-6擴(kuò)增結(jié)果顯示在3350 bp附近沒有條帶，說明過表達(dá)藻株OE0528-6中三個片段沒有插入到預(yù)期的中性位點，或者可能是引物3031-2-L和3031-2-R和OE0528-6基因組的結(jié)合位點發(fā)生變化導(dǎo)致引物無法正常結(jié)合而擴(kuò)增。

為進(jìn)一步驗證結(jié)果，以3031-1-L，3031-1-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增集胞藻slr2030和slr2031間中性位點被取代的部分，野生型結(jié)果為slr2030和slr2031中間部分，長度為610 bp；過表達(dá)藻株中，過表達(dá)元件三個片段完全取代中性位點slr2030和slr2031中間部分時，擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)當(dāng)為沒有任何條帶；三個片段不完全取代中性位點時，擴(kuò)增結(jié)果會有條帶于610 bp處。結(jié)果如圖4B所示，野生型PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳后條帶在610 bp附近，6株過表達(dá)藻株擴(kuò)增結(jié)果都沒有條帶于610 bp處。進(jìn)一步說明過表達(dá)藻株中 kmr+啟動子PpsbA2+sll0528三個片段完全取代中性位點。這些結(jié)果說明 sll0528的過表達(dá)元件在藻株 OE0528-1、OE0528-2、OE0528-3、OE0528-4、OE0528-5 中正確插入預(yù)定位置，但這些藻株中基因sll0528表達(dá)量是否高于WT仍需要進(jìn)一步實驗證明。

2.2.2 RNA水平上鑒定

收集WT和6株過表達(dá)藻株OE0528培養(yǎng)至第4 d的藻液，提取RNA，設(shè)計引物sll0528-2-L，sll0528-2-R（表1），通過RT-qPCR實驗考察過表達(dá)藻株中基因sll0528是否過表達(dá)。得到目標(biāo)基因和參照基因的 CT值，用?CT值法，算出目標(biāo)基因的表達(dá)量，并計算相對于WT基因sll0528的表達(dá)量（圖5）。

圖5a RT-qPCR擴(kuò)增曲線中各樣品兩個基因的擴(kuò)增曲線相互聚集，圖5b RT-qPCR溶解曲線中兩個基因各自引物的峰值單一，都顯示出引物特異性好，實驗結(jié)果可靠。其中OE0528和WT中的rnpB基因擴(kuò)增曲線基本重疊，說明rnpB在OE0528和WT表達(dá)量恒定，適合作為內(nèi)參。以WT中sll0528的表達(dá)量為1，過表達(dá)藻株 OE0528-1、OE0528-2、OE0528-3、OE0528-4、OE0528-5，OE0528-6中基因sll0528相對表達(dá)量分別是12.48、19.93、19.22、25.31、17.37（圖5c），相對于WT，過表達(dá)藻株中sll0528表達(dá)量明顯提高。說明啟動子PpsbA2+sll0528基因片段在過表達(dá)藻株OE0528中成功插入并有效表達(dá)。6株過表達(dá)藻株中OE0528-4基因sll0528的相對表達(dá)量最高。

圖5 OE0528在RNA水平的鑒定Fig.5 Identification of the OE0528 at the RNA level

2.3 過表達(dá)藻株OE0528的生長曲線

圖6 OE0528的生長曲線Fig.6 Growth curve of the OE0528

為研究sll0528的過表達(dá)對集胞藻PCC6803的正常生長是否有影響，將 6株過表達(dá)藻株 OE0528和WT以起始濃度OD730=0.1開始，在正常條件下連續(xù)培養(yǎng)5 d，并且每24 h取樣測定OD730值，測得OD730值繪制成生長曲線，如圖6所示。從圖中可以看出，6株過表達(dá)藻株OE0528生長曲線和WT生長曲線相近，各過表達(dá)藻株分別和WT對比進(jìn)行顯著性分析，所有p＞0.05，無顯著性差異。其中OE0528-4生長速率稍慢，但sll0528在OE0528-4中表達(dá)量最高（圖5b），是否由于基因sll0528的高表達(dá)導(dǎo)致其生長速率降低，有待后續(xù)驗證。后續(xù)脅迫實驗采用過表達(dá)藻株OE0528-3，后續(xù)陳述中將其命名為OE0528。

2.4 缺失藻株?sll0528在氯化銨脅迫下的生長情況

圖7 ?sll0528在氯化銨脅迫下的生長曲線和全細(xì)胞吸收圖Fig.7 Growth curve and whole-cell absorption spectra of?sll0528 under ammonium chloride stress

考察 sll0528基因?qū)屙憫?yīng)銨鹽脅迫的功能與作用，首先利用之前構(gòu)建的敲除 sll0528缺失藻株?sll0528進(jìn)行氯化銨脅迫實驗。?sll0528構(gòu)建采用同源重組雙交換，用氯霉素抗性基因 cmr替換集胞藻PCC6803中的sll0528，達(dá)到完全敲除sll0528目的[12]。WT和?sll0528分別在終濃度0 mM、90 mM、105 mM、120 mM的氯化銨，正常溫度光照轉(zhuǎn)速條件下，連續(xù)培養(yǎng)5 d，繪制生長曲線（圖7a），并于第5 d測定全細(xì)胞吸收值（圖7c）。從圖7a中可以看出，WT在90 mM、105 mM濃度氯化銨下生長曲線和未加氯化銨下差異不大，WT生長并沒有受到太多影響，在120 mM濃度氯化銨條件下，WT生長速率稍微減弱。說明WT能適應(yīng)低濃度氯化銨，在高濃度氯化銨下生長會稍微受影響。而?sll0528的生長速率隨著氯化銨濃度增加明顯變慢，在120 mM濃度氯化銨下生長速率為OD7300.02/d。說明?sll0528對銨鹽生長環(huán)境敏感，隨著氯化銨濃度增加生長趨勢明顯變緩。對比WT和缺失藻株?sll0528，缺失基因sll0528的?sll0528對銨鹽環(huán)境表現(xiàn)較為敏感，說明基因sll0528在適應(yīng)銨鹽環(huán)境起著重要作用。

比較WT和缺失藻株?sll0528在120 mM氯化銨條件下培養(yǎng)至第5 d的藻液顏色（圖7b），缺失藻株?sll0528接近透明無色，和WT相比幾乎沒有生長，說明基因 sll0528對集胞藻適應(yīng)銨鹽脅迫必不可少。WT加氯化銨條件和未加氯化銨相比顏色略淺，表明120 mM氯化銨對WT生長有一定影響。

進(jìn)一步觀察WT和?sll0528在120 mM氯化銨條件下培養(yǎng)至第5 d的全細(xì)胞吸收圖（圖7c）。集胞藻PCC6803在全細(xì)胞吸收光譜中有三個特征峰，類胡蘿卜素：500 nm～550 nm，藻藍(lán)蛋白：600 nm～650 nm，葉綠素：680 nm，藻藍(lán)蛋白和葉綠素分別是藻膽體和光合系統(tǒng)的重要組成部分，藻膽體作為天線系統(tǒng)和光合系統(tǒng)相互作用推動光合作用的進(jìn)行[17]，所以藻藍(lán)蛋白和葉綠素的含量與光合作用呈正相關(guān)。圖中可以看到，120 mM氯化銨下第5 d，WT的葉綠素和藻藍(lán)蛋白峰值高于缺失藻株?sll0528，提示 WT優(yōu)于缺失藻株?sll0528的光合系統(tǒng)功能，部分解釋了WT在120 mM氯化銨條件下能生長，而?sll0528幾乎不能生長。說明基因sll0528對集胞藻PCC6803適應(yīng)銨鹽脅迫的重要作用，它的缺失導(dǎo)致缺失藻株?sll0528在120 mM氯化銨條件下幾乎不生長。

同時WT在氯化銨條件下的葉綠素和藻藍(lán)蛋白峰值明顯低于其未加銨鹽條件下，和WT在120 mM氯化銨條件下生長速率慢于WT未加銨鹽的現(xiàn)象相符。

2.5 過表達(dá)藻株OE0528在氯化銨脅迫下的生長情況

圖8 OE0528在氯化銨脅迫下的生長曲線和全細(xì)胞吸收圖Fig.8 Growth curve and whole-cell absorption spectra of OE0528 under ammonium chloride stress

基因sll0528的敲除導(dǎo)致缺失藻株?sll0528對氯化銨比較敏感，就此探究過表達(dá)藻株 OE0528是否比WT更耐受高濃度氯化銨，故需比較過表達(dá)藻株OE0528和WT在高濃度氯化銨條件下的生長情況。首先對WT進(jìn)行高濃度氯化銨培養(yǎng)，找出WT不能耐受的氯化銨濃度。六孔板實驗結(jié)果顯示，在高濃度氯化銨培養(yǎng)下WT生長受阻的現(xiàn)象隨銨鹽濃度上升而明顯加?。▓D8a），180 mM氯化銨對WT生長影響大，第3 d、第5 d OD730值僅為對照組未添加氯化銨的67%和 57%。故選用 180 mM 氯化銨來對比過表達(dá)藻株OE0528和WT的生長狀況。

如圖 8b所示，180 mM 氯化銨下，過表達(dá)藻株OE0528生長明顯優(yōu)于WT，第三天起與WT有顯著差異，第5 d時，OD730為WT的1.72倍。說明過表達(dá)藻株OE0528相對于WT更能耐受高濃度氯化銨，基因sll0528的過表達(dá)有利于過表達(dá)藻株OE0528適應(yīng)銨鹽脅迫。

圖8c中，在180 mM氯化銨下培養(yǎng)至第5 d的藻液圖片顯示，WT顏色淺綠泛白，透徹清亮，而過表達(dá)藻株OE0528比WT顏色要深得多，顯示正常的深綠色，提示旺盛的生長。從第5 d的全細(xì)胞吸收圖（圖8d）看到，180 mM氯化銨下，WT的葉綠素和藻藍(lán)蛋白峰值明顯低于過表達(dá)藻株 OE0528，說明在 180 mM氯化銨條件下WT的光合系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷，光合作用受到較大影響，而OE0528的光合系統(tǒng)卻得到保護(hù)或進(jìn)行了修復(fù)，損傷并不明顯，光合作用受到較小影響。這些結(jié)果說明，過表達(dá)藻株OE0528比WT更能適應(yīng)高濃度的氯化銨脅迫，揭示基因sll0528在集胞藻PCC6803耐受高濃度銨鹽脅迫中起重要作用。

NH4+作為簡單的無機(jī)鹽形式是植物和藻類的優(yōu)選氮源，它被同化摻入碳骨架利用。低濃度的銨被銨/甲基銨轉(zhuǎn)運酶 Amt攝入，該酶的活性受氮狀態(tài)影響[18]，高濃度銨鹽影響生物正常生長。細(xì)菌中有兩種銨和碳骨架2-酮戊二酸結(jié)合的途徑：直接通過谷氨酸脫氫酶GDH或者先后通過谷胺酰胺合成酶GS和谷氨酸合成酶GOGAT的作用。但藍(lán)藻中GS-GOGAT循環(huán)是銨同化的主要途徑[19]。GDH缺失的集胞藻PCC6803缺失藻株在正常條件下銨的同化不受影響[20]。藍(lán)藻中存在兩種GS酶和兩種GOGAT酶[21]。有趣的是，集胞藻PCC6803中GS酶的作用會因過量銨的攝入而被弱化[22]，提示過量銨存在時，機(jī)體需要調(diào)低銨攝入或銨同化機(jī)制以保護(hù)正常生長。有研究表明微藻的生長在低生物量密度時對銨更為敏感[23]，說明銨鹽毒性可能與光合系統(tǒng)的捕光能力相關(guān)；研究氨對微藻的抑制作用，表明高氨引起高PH直接影響微藻的光合作用[24]；銨鹽對集胞藻的作用位點機(jī)制是銨鹽促發(fā)了PS II的放氧復(fù)合物（OEC）的光損傷；且銨鹽耐受力與位于PS II的psbA多基因家族成員相關(guān)[25,26]。

通過WT和sll0528缺失藻株?sll0528在120 mM氯化銨條件下培養(yǎng)，觀察到WT生長稍微受影響，而?sll0528幾乎不生長，分析培養(yǎng)至第5 d的全細(xì)胞吸收圖，發(fā)現(xiàn)?sll0528的藻藍(lán)蛋白和葉綠素合成嚴(yán)重受損，表明缺失基因sll0528的?sll0528對銨鹽脅迫更敏感。而WT和過表達(dá)藻株OE0528在180 mM氯化銨條件下培養(yǎng)，觀察到WT生長受到較嚴(yán)重阻礙，生長速率是對照組未加氯化銨下的一半，OE0528的生長只是稍微受到影響，同樣地，分析培養(yǎng)至第5 d的全細(xì)胞吸收圖，發(fā)現(xiàn)180 mM氯化銨下OE0528比WT的藻藍(lán)蛋白和葉綠素峰值明顯更高，推測OE0528的色素合成途徑輕微受損或恢復(fù)得較好，說明過表達(dá)藻株OE0528比WT更耐受180 mM氯化銨。

Sll0528是集胞藻PCC6803四個S2P蛋白酶中響應(yīng)脅迫種類最多、響應(yīng)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最高的一個[12]，但是它對銨鹽脅迫響應(yīng)的功能與機(jī)理是首次被研究。作為調(diào)節(jié)跨膜信號傳導(dǎo)的保守機(jī)制，S2P蛋白酶調(diào)控的膜內(nèi)蛋白水解機(jī)制可以在機(jī)體受到外界脅迫時，感知信號、傳遞信號并激活相應(yīng)基因的表達(dá)，以維持機(jī)體適應(yīng)外界環(huán)境。

上述對 sll0528缺失藻株?sll0528和過表達(dá)藻株OE0528在銨鹽脅迫下的研究顯示，Sll0528顯然參與了銨鹽脅迫的快速響應(yīng)，可能介導(dǎo)了高銨鹽濃度下對光合系統(tǒng)的保護(hù)或修復(fù)機(jī)制。后續(xù)進(jìn)一步的實驗將分析WT，OE0528，?sll0528在氯化銨脅迫下的轉(zhuǎn)錄組和代謝組，深入闡明 Sll0528如何通過膜內(nèi)蛋白水解機(jī)制調(diào)控集胞藻適應(yīng)銨鹽脅迫。

3 結(jié)論

本文通過構(gòu)建集胞藻PCC6803基因sll0528過表達(dá)藻株OE0528，和已經(jīng)構(gòu)建的sll0528敲除的缺失藻株?sll0528，對比野生型，研究集胞藻PCC6803在氯化銨脅迫下的生長表型，發(fā)現(xiàn)?sll0528比WT對銨鹽脅迫更敏感，OE0528則比WT更耐受高濃度的銨鹽，表明Sll0528在集胞藻PCC6803適應(yīng)銨鹽脅迫中發(fā)揮重要的作用，參與了銨鹽脅迫的快速響應(yīng)，推測Sll0528直接或間接介導(dǎo)高銨鹽濃度下對光合系統(tǒng)的保護(hù)或修復(fù)機(jī)制。本研究初步揭示集胞藻中S2P蛋白酶 Sll0528對銨鹽脅迫的響應(yīng)作用與機(jī)制，為未來揭示微藻對銨鹽的響應(yīng)機(jī)制和提高微藻對銨鹽的耐受性和利用率奠定基礎(chǔ)。