朱婷，馮玉，殷樂章,，王曉靜，肖靜，孫冰

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100193）

（2.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250355）

心肌肥厚是導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，是心血管疾病患者發(fā)病率和死亡率增加的一個(gè)重要原因。心肌肥厚是由多種刺激引起的多方面復(fù)雜的臨床綜合征，與多種病理特征有關(guān)，包括心臟收縮功能和舒張功能衰退，心肌細(xì)胞死亡，心肌炎癥和心臟纖維化重塑的增加等[1,2]。研究表明，炎癥反應(yīng)不僅參與了心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程，并且與心室重構(gòu)密切相關(guān)。炎癥因子在心室重構(gòu)過程中起到重要作用，包括誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、胚胎基因表達(dá)、心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化等[3]。異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)是一種β-腎上腺素能激動(dòng)劑，特定劑量可以誘導(dǎo)心肌肥厚，使心肌中促炎因子如腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素-6（IL-6）表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的表達(dá)，已廣泛用于建立心肌肥厚實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚4,5]。

三七總皂苷是人參屬中藥三七的主要有效活性成分[6,7]。三七皂苷R1（notoginsenoside R1），是一種從三七中分離出的主要成分和新型植物雌激素，具有抗炎，抗氧化和抗凋亡性質(zhì)[8～10]。之前的研究表明，三七皂苷R1能明顯抑制多種炎癥因子的產(chǎn)生，減輕內(nèi)毒素小鼠心臟功能紊亂癥狀[11],但其對(duì)心肌肥厚的影響少有報(bào)導(dǎo)。因此，本實(shí)驗(yàn)的主要目的為通過異丙腎上腺素刺激心肌細(xì)胞誘導(dǎo)心肌肥大的發(fā)生，觀察三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響。首先，采用不同給藥劑量給予三七皂苷 R1，觀察不同給藥劑量對(duì) ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響?；谘装Y反應(yīng)在心肌肥厚發(fā)展病程中占有重要地位，本實(shí)驗(yàn)從組織形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等多個(gè)水平，探討三七皂苷R1對(duì)心肌肥厚及心肌炎癥反應(yīng)的作用，為進(jìn)一步深入研究其機(jī)制提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

H9c2心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（中國上海）。

1.1.2 藥品與試劑

三七皂苷R1，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：161020；ISO，購自 Sigma公司，產(chǎn)品批號(hào)：16504；所有組織培養(yǎng)物質(zhì)購自GIBCO公司；I-κBα抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，批號(hào)為：K0711；p65、p-p65抗體購自CST公司，批號(hào)分別為：8242和3033；RT-PCR試劑盒購自鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為：TER010-2；western試劑盒購自康維世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)為：26912F；熒光測(cè)定試劑盒購自 BioVision公司，批號(hào)為：K105-100；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為去離子水。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞模型的建立

如文獻(xiàn)[12]所述進(jìn)行培養(yǎng)，首先將細(xì)胞分為正常對(duì)照組，ISO（20 μg/mL）組及三七皂苷R1不同濃度（5μM，10 μM，25 μM，50 μM）給藥組，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)后，選擇最佳給藥濃度（25 μM）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。給藥組加入選擇性 NF-κB拮抗劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）預(yù)先培養(yǎng)30 min后加入三七皂苷R1，1 h后加入ISO，24 h后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)共分為6組：①正常對(duì)照組；②三七皂苷R1組（25 μM）；③PDTC組；④ISO組（20 μg/mL）；⑤ISO+三七皂苷R1組；⑥ISO+三七皂苷R1+PDTC組。用以檢測(cè)三七皂苷R1對(duì)NF-κB介導(dǎo)的抗炎和抗凋亡作用。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

使用 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）測(cè)定法，如上所述[12]評(píng)估細(xì)胞活力。

1.2.3 細(xì)胞表面積的測(cè)量

為了研究三七皂苷R1對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌肥大的保護(hù)作用，將細(xì)胞置于6孔板中。如上所述[12]進(jìn)行培養(yǎng)和處理。將預(yù)處理的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，然后固定在4%多聚甲醛中。10 min后，用0.1% Triton X-10（V/V，加在PBS中）洗滌三次，除去殘留的多聚甲醛。然后在1：100稀釋液（含有2% BSA和0.1% Triton X-100的PBS）中加入Actin-Tracker Green。六孔板中的細(xì)胞在室溫黑暗條件下培養(yǎng)30～60 min，0.1%Triton X-100除去過量的Actin-Tracker Green。在裝有200×放大倍率數(shù)碼相機(jī)的倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，每孔隨機(jī)捕獲5張照片，并使用Image J軟件測(cè)量單個(gè)細(xì)胞表面積。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)ANF、β-MHC、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 表達(dá)

實(shí)時(shí)定量 RT-PCR法檢測(cè)心房利鈉因子(Atrial natriuretic factor，ANF)、β-肌球蛋白重鏈（beta-myosin heavy chain，β-MHC）、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-1β (interleukin-1 beta，IL-1β)的 mRNA 表達(dá)水平。使用Trizol試劑分離總RNA。用Prime Script RT Master Mix試劑盒合成 cDNA。使用 SYBR green premix進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)。使用以下引物進(jìn)行cDNA擴(kuò)增：ANF：5'-AGCATGGGCTCCTTCTCCAT-3'(forward)和 5'-TGGCCTGGAAGCCAAAAG-3'(reverse)；β-MHC：5'-CCTACAAGTGGCTGCCTG TGT-3'(forward)和 5'-ATGGACTGATTCTCCCGAT CTG-3'(reverse)；TNF-α：5'-CATCTTCTCAAAATTC GAGTGACAA-3'(forward)和 5'-TGGGAGTAGACA AGGTACAACCC-3'(reverse)；IL-1β：5'-CAACCAAC AAGTGATATTCTCCATG-3'(forward)和5'-GATCCAC ACTCTCCAGCTGCA-3'(reverse)；IL-6：5'-GAGGAT ACCACTCCCAACAGACC-3'(forward)和5'-AAGTGC ATCATCGTTGTTCATACA-3'(reverse)；GAPDH：5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'（forward）和5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'（reverse）；使用delta delta CT方法，所有基因表達(dá)均與內(nèi)參照基因（即GAPDH）的標(biāo)準(zhǔn)化相同，使用任意單位顯示相對(duì)mRNA水平，并將對(duì)照組的值定義為1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由熒光定量 PCR分析軟件 Applied Biosystems Primer Express Software (version 2.0)自動(dòng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算[11]。

1.2.5 western blot法檢測(cè) I-κBα、p65、p-p65蛋白表達(dá)

如前所述[12]進(jìn)行細(xì)胞裂解物制備，收集總蛋白。用BCA法蛋白定量。取等量樣本上樣于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，搖床封閉 1 h，然后加入甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、NF-κBα 抑制蛋白（inhibitor of NF-κBα，I-κBα）、p65和 phosphorylation p65（p-p65）的一抗(均為 1：1000 稀釋)，4 ℃過夜。次日，室溫下TBST洗膜，二抗孵育1 h后洗膜，曝光顯影。以GAPDH作內(nèi)參，灰度分析。

1.2.6 熒光分光光度法檢測(cè)Caspase-3活性

根據(jù)制造商的說明書，使用熒光測(cè)定試劑盒測(cè)定含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)活性。使用具有400 nm激發(fā)波長和505 nm發(fā)射波長的Fluoroskan Ascent FL熒光計(jì)讀取樣品的熒光強(qiáng)度。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與討論

2.1 三七皂苷R1對(duì)細(xì)胞活力的影響

為了檢測(cè)ISO和三七皂苷R1的細(xì)胞毒性作用，在5，10，25和50 μM三七皂苷R1作用下，將H9c2細(xì)胞與指定濃度的ISO（20 μg/mL）一起培養(yǎng)24 h。然后，使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。

表1結(jié)果所示，隨著ISO濃度（0～20 μM）的增加，細(xì)胞活力逐漸降低。而給予不同濃度三七皂苷R1（0，5，10，25和50 μM），各組之間的細(xì)胞活力沒有顯著差異（p＞0.05）。此外，與空白對(duì)照組相比，用ISO處理過的 H9c2細(xì)胞的細(xì)胞活力降低了約 40%（p＜0.05）。然而，三七皂苷R1以濃度依賴方式（5，10和25 μM）抑制了這種降低（p＜0.05）。值得注意地是，25 μM 三七皂苷 R1處理組細(xì)胞活力提高到約93%。然而，較高濃度（50 μM）的三七皂苷R1不能進(jìn)一步提高細(xì)胞活力。

表1 三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響Table 1 Effects of notoginsenoside R1 on the viability of cardiomyocytes(±s, n=5)

表1 三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響Table 1 Effects of notoginsenoside R1 on the viability of cardiomyocytes(±s, n=5)

注：與對(duì)照組相比#p＜0.05；與ISO處理組相比*p ＜0.05（下同）。

組別 劑量 細(xì)胞活力/%正常對(duì)照 99.13±5.67異丙腎上腺素 0 μg/mL 99.12±7.56異丙腎上腺素 0.002 μg/mL 93.53±11.71異丙腎上腺素 0.02 μg/mL 90.10±6.82異丙腎上腺素 0.2 μg/mL 81.07±5.48#異丙腎上腺素 2 μg/mL 76.35±8.67#異丙腎上腺素 20 61.22±2.37#三七皂苷 R1 0 μM 99.30±5.33三七皂苷 R1 5 μM 98.21±6.22三七皂苷 R1 10 μM 101.87±5.28三七皂苷 R1 25 μM 101.41±6.28三七皂苷 R1 50 μM 103.93±3.98異丙腎上腺素+三七皂苷 R1 5 μM 20 μg/mL 74.64±3.14*異丙腎上腺素+三七皂苷 R1 10 μM 20 μg/mL 84.36±6.76*異丙腎上腺素+三七皂苷 R1 25 μM 20 μg/mL 92.85±4.74*異丙腎上腺素+三七皂苷 R1 50 μM 20 μg/mL 93.75±5.49*

表2 三七皂苷R1對(duì)ANF和β-MHC mRNA水平的影響Table 2 Effects of Notoginsenoside R1 on mRNA level of ANF and β-MHC(±s, n=5)

表2 三七皂苷R1對(duì)ANF和β-MHC mRNA水平的影響Table 2 Effects of Notoginsenoside R1 on mRNA level of ANF and β-MHC(±s, n=5)

組別 劑量/(μg/mL) ANF mRNA β-MHC mRNA正常對(duì)照 1.00±0.24 1.00±0.31異丙腎上腺素 20 10.89±1.58# 9.92±0.73#異丙腎上腺素+三七皂苷 R1 5 μM 20 8.91±1.33* 8.38±0.99*異丙腎上腺素+三七皂苷R1 10 μM 20 6.28±0.87* 5.45±0.87*異丙腎上腺素+三七皂苷R1 25 μM 20 5.16±0.18* 4.35±0.38*異丙腎上腺素+三七皂苷R1 50 μM 20 5.73±1.19* 4.48±0.33*

2.2 三七皂苷R1對(duì)ANF和β-MHC mRNA水平的影響

病理性心肌肥厚主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、原始胚胎基因表達(dá)增強(qiáng)，是心血管疾病的共同病理特征。ANP和β-MHC是重要的心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物。ANP作為心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物之一，在正常成年哺乳動(dòng)物的心肌中幾乎無表達(dá)，但在心肌肥厚動(dòng)物的心肌中表達(dá)較高。因此 ANP表達(dá)量的多少，可以準(zhǔn)確地反映心肌肥厚的程度[13]。

心肌纖維主要由肌球蛋白構(gòu)成，是心肌的主要收縮蛋白，α-MHC和β-MHC作為肌球蛋白的兩種表達(dá)形式分別主要存在于大鼠心室肌及胚胎期[14]。壓力超負(fù)荷引起的心肌機(jī)械牽張或神經(jīng)體液因子產(chǎn)生，使心肌細(xì)胞肥大從而上β-MHC的表達(dá)，而β-MHC的下調(diào)又可以使肌球蛋白ATP酶活性低，從而導(dǎo)致心臟收縮速率下降，最終導(dǎo)致心力衰竭[15]。因此，β-MHC也被視為心肌肥厚的分子標(biāo)志。

因此本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定ANP和β-MHC以評(píng)價(jià)三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞肥大程度的影響。表2結(jié)果所示，ISO（20 μg/mL）顯著增加了ANF和β-MHC的m RNA水平（p＜0.05），說明ISO（20 μg/mL）對(duì)大鼠心肌細(xì)胞已造成嚴(yán)重的肥大損傷；而隨著三七皂苷R1濃度的升高（5，10和25 μM），這種升高作用被明顯降低（p＜0.05），與模型組相比，ANF分別降低了18.18%、42.33%、52.62%；β-MHC分別降低了15.52%、45.06%、56.15%。然而，較高濃度的三七皂苷R1（50 μM）并沒有進(jìn)一步降低 ANF和 β-MHC的 mRNA水平（p＞0.05），與25 μM組相比，僅相差9.95%和2.9%?？赡苁怯捎?5 μM已經(jīng)為三七皂苷R1治療心肌細(xì)胞肥大的最佳給藥劑量。

2.3 三七皂苷R1保護(hù)心肌免受ISO誘導(dǎo)的肥大

形態(tài)學(xué)分析進(jìn)一步研究了三七皂苷R1對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌肥大的保護(hù)作用。與對(duì)照組相比，ISO誘導(dǎo)后，心肌細(xì)胞表面積會(huì)增大，應(yīng)用三七皂苷R1（5，10，25和50 μM）能夠有效防止ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，與模型組相比，分別降低 18.02%、21.81%、24.50%、26.39%。然而，不同濃度的三七皂苷R1對(duì)于阻止心肌細(xì)胞表面積并沒有顯著差異（表3）。

表3 ISO和/或三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞大小的變化Table 3 Changes in cardiomyocyte size in response to ISO or Notoginsenoside R1(±s, n=5)

表3 ISO和/或三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞大小的變化Table 3 Changes in cardiomyocyte size in response to ISO or Notoginsenoside R1(±s, n=5)

組別 劑量/(μg/mL) 細(xì)胞面積(Arbitrary units)正常對(duì)照 99.30±5.84異丙腎上腺素 20 162.10±16.30#異丙腎上腺素+三七皂苷R1 5 μM 20 132.89±8.58*異丙腎上腺素+三七皂苷R1 10 μM 20 126.74±9.89*異丙腎上腺素+三七皂苷R1 25 μM 20 122.38±6.44*異丙腎上腺素+三七皂苷R1 50 μM 20 119.32±5.55*

2.4 三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞中ISO誘導(dǎo)的炎癥的影響

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，心肌炎癥因子表達(dá)的下調(diào)可以降低心室重塑的發(fā)生率，對(duì)心力衰竭具有保護(hù)作用[16]。炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）是誘發(fā)心血管疾病的常見因素之一。在病理情況下，心肌易受到各種因素刺激，生理狀態(tài)下的平衡被打破，促使促炎因子大量產(chǎn)生、心肌肥厚及心肌纖維化產(chǎn)生[17]。

表4 三七皂苷R1對(duì)TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平的影響Table 4 Effects of ISO and/or Notoginsenoside R1 on the mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6(±s, n=5)

表4 三七皂苷R1對(duì)TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平的影響Table 4 Effects of ISO and/or Notoginsenoside R1 on the mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6(±s, n=5)

組別 劑量/(μg/mL) TNF-α mRNA IL-1β mRNA IL-6 mRNA正常對(duì)照 1.00±0.93 1.10±0.22 0.99±0.21異丙腎上腺素 20 19.72±2.29# 4.11±0.83# 7.70±1.12#三七皂苷R1 25 μM 1.02±0.90 1.23±0.15 1.13±0.26異丙腎上腺素+三七皂苷R1 25 μM 20 6.44±1.61* 2.82±0.62* 3.34±0.47*

另外，炎癥因子的調(diào)控與NF-κB相關(guān)，NF-κB可被LPS、TNF-α等炎癥因子激活，促進(jìn)心室重構(gòu)的發(fā)展。已有研究報(bào)道，在心肌組織中NF-κB通路的阻斷在預(yù)防高血壓心肌肥厚中具有良好的應(yīng)用前景[18]。

因此本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定 TNF-α、IL-1β和 IL-6的mRNA水平以評(píng)價(jià)三七皂苷R1對(duì)心肌炎癥因子表達(dá)影響。表4結(jié)果所示，與正常對(duì)照組相比，單獨(dú)給予三七皂苷R1對(duì)TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA水平并無顯著性差異（p＞0.05）。然而，細(xì)胞暴露于ISO時(shí)，各炎癥因子mRNA表達(dá)水平顯著增加（p＜0.05），三七皂苷R1處理后，TNF-α，IL-1β和IL-6 mRNA水平被顯著抑制（p＜0.05），與模型組相比，分別降低67.34%、31.39%、56.62%，表明三七皂苷R1有效抑制心肌炎癥因子mRNA水平表達(dá)，減少心肌肥厚發(fā)生。

2.5 三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞中p65磷酸化和I-κBα 的影響

NF-κB（Nuclear factor- kappa B)是一種存在于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，NF-κB信號(hào)通路可作為心肌肥厚的潛在治療靶點(diǎn)[19]。P50和p65作為NF-κB家族的兩個(gè)亞單位以二聚體的形式存在于胞漿內(nèi)，是其活性的主要表現(xiàn)形式。而作為蛋白復(fù)合體的IκB蛋白激酶通過介導(dǎo)IκB的激活進(jìn)而活化IκB磷酸化激酶，導(dǎo)致IκB發(fā)生構(gòu)象改變并降解，NF-κB激活并移位進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)核因子轉(zhuǎn)錄[20]。

Western blot結(jié)果顯示，ISO引起NF-κB p65亞基磷酸化的增加，I-κBα水平降低。相反的是，p65磷酸化和I-κBα水平的降低在25 μM三七皂苷R1預(yù)處理下明顯反轉(zhuǎn)（p＜0.05），與模型組相比，p65降低71.32%，I-κBα增加37.61%（圖1、表5）。結(jié)果表明，ISO不僅是誘導(dǎo)心肌肥大導(dǎo)致心肌損傷的有力刺激因子，而且是I-κBα降解和p65磷酸化的炎癥啟動(dòng)因子，促使NF-κB信號(hào)通路的激活。

圖1 三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞p65、p-p65及I-κBα蛋白表達(dá)的影響Fig.1 The effects of Notoginsenoside R1 on p65, p-p65 and I-κBα in cardiomyocytes

表5 三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞p65、p-p65及I-κBα蛋白表達(dá)的影響Table 5 The effects of Notoginsenoside R1 on p65, p-p65 and I-κBα in cardiomyocytes(±s, n=5)

表5 三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞p65、p-p65及I-κBα蛋白表達(dá)的影響Table 5 The effects of Notoginsenoside R1 on p65, p-p65 and I-κBα in cardiomyocytes(±s, n=5)

組別 劑量/(μg/mL) p65 磷酸化水平(p-p65/p65) I-κBα 表達(dá)量(I-κBα/GAPDH)異丙腎上腺素 20 1.36±0.12 0.68±0.15異丙腎上腺素+三七皂苷R1 25 μM 20 0.39±0.19* 1.09±0.2*

2.6 三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞肥大的抑制作用與NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)

隨著NF-κB的活化，其下游炎癥因子如TNF-α，IL-6和IL-1β的水平升高。在這些炎癥因子中，TNF-α一方面通過促進(jìn) IL-6等的表達(dá)進(jìn)一步促使炎癥的發(fā)生，另一方面激活Caspase誘導(dǎo)的凋亡促進(jìn)心肌重塑的發(fā)生[21]。

將H9c2細(xì)胞用PDTC（NF-κB的特異性抑制劑）處理30 min，給予三七皂苷R1（25 μM）1 h，然后用ISO（20 μg/mL）處理 24 h。

如表6所示，與空白對(duì)照組相比，ISO顯著提高了ANF mRNA的水平（p＜0.05）。給予三七皂苷R1后，這種升高會(huì)被顯著降低（p＜0.05），與模型組相比，ANF降低55.04%；在PDTC共同處理下，這種抑制又被顯著反轉(zhuǎn)（p＜0.05），與模型+給藥組相比，ANF升高22.46%。與三七皂苷R1對(duì)ANF活性的抑制作用相似，三七皂苷R1顯著抑制ISO誘導(dǎo)的Caspase-3的表達(dá)（p＜0.05），與模型組相比，Caspase-3降低47.37%；而與PDTC共同處理時(shí)，這種抑制又會(huì)被顯著反轉(zhuǎn)（p＜0.05），與模型+給藥組相比，Caspase-3升高 34.46%。另外，單獨(dú)用三七皂苷 R1對(duì) ANF和Caspase-3的表達(dá)沒有顯著影響（p＞0.05）。這些數(shù)據(jù)表明，三七皂苷R1對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌肥大的抑制作用與NF-κB的抑制密切相關(guān)。

表6 三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響與NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)Table 6 The effects of Notoginsenoside R1 on hypertrophy in cardiomyocytes is associated with NF-κB signalling

3 結(jié)論

3.1 本文在成功制備 ISO致心肌細(xì)胞肥大模型的基礎(chǔ)上，探究了三七皂苷R1對(duì)大鼠H9c2細(xì)胞心肌肥大的保護(hù)作用，結(jié)果顯示：三七皂苷R1各劑量組自身對(duì)心肌細(xì)胞活力并無明顯差異，但給予ISO處理后，三七皂苷R1各劑量組明顯抑制了ISO所致的細(xì)胞活力的降低，并顯著降低ISO所致的ANF和β-MHC的m RNA表達(dá)水平，心肌細(xì)胞表面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果也顯示三七皂苷R1有明顯的改善心肌細(xì)胞肥大的作用。

3.2 在上述研究結(jié)果基礎(chǔ)上，從炎癥方面探究了三七皂苷R1對(duì)大鼠H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果表明，ISO不僅是誘導(dǎo)心肌肥大導(dǎo)致心肌損傷的有力刺激因子，而且是I-κBα降解和p65磷酸化的炎癥啟動(dòng)因子，促使NF-κB信號(hào)通路的激活。數(shù)據(jù)還顯示，隨著NF-κB的活化，其下游炎癥因子如TNF-α，IL-6和IL-1β的水平升高。在這些炎癥因子中，TNF-α的上調(diào)可以直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，如通過心肌細(xì)胞中 Caspase-3的激活所證實(shí)。此外，與三七皂苷R1類似，NF-κB抑制劑PDTC也部分抑制了ISO誘導(dǎo)的ANF mRNA的表達(dá)。同時(shí)，PDTC抑制了 ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中Caspase-3的活化。因此，三七皂苷R1可以通過阻斷NF-κB信號(hào)通路來保護(hù)心肌細(xì)胞以免ISO誘導(dǎo)的心肌肥大。

3.3 總之，本研究表明，三七皂苷R1預(yù)處理能改善細(xì)胞存活力，降低心肌細(xì)胞面積，減弱ISO引起的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制心肌細(xì)胞中NF-κB的活化。雖然三七皂苷R1預(yù)處理顯著抑制了ISO誘導(dǎo)的心肌功能障礙和心肌細(xì)胞中的炎癥因子表達(dá)，但是三七皂苷R1對(duì)心肌肥厚的治療作用的研究尚不完善。因此，需要進(jìn)行更全面的研究來驗(yàn)證三七皂苷R1治療心肌肥大的病理機(jī)制，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。