李菲，王永華，藍(lán)東明

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

傳統(tǒng)的有毒有害的有機(jī)溶劑不符合綠色環(huán)保的理念，而溶劑在食品以及生物催化領(lǐng)域具有非常重要的作用，所以人們對于新型的綠色溶劑的需求日益迫切。離子液體（ILs）是近年發(fā)展起來應(yīng)用于生物催化的“綠色”溶劑[1]。離子液體（ILs）具有獨特的性質(zhì)，包括不可揮發(fā)性、良好的穩(wěn)定性以及不可燃性等。但目前由季銨鹽（如氯化膽堿和甜菜堿）和氫鍵供體（hydrogen bond donor，HBD）（如糖、多元醇和有機(jī)酸）形成的混合物即低共熔溶劑 DES（deep eutectic solvent，DES）有望代替“離子液體”[2]。因為DES不僅具有離子液體的優(yōu)點，同時還兼具成本低、易制備、高度生物降解性以及生物相容性等特點，更符合“綠色化學(xué)”的理念[3,4]。DES一個顯著的特點是，其熔點通常低于組成DES的任何單一組分的熔點，這與DES體系中季銨鹽的陰離子和氫鍵供體之間形成的氫鍵作用有關(guān)[5,6]。

天然低共熔溶劑（natural deep eutectic solvent，NADES）是指由生物體內(nèi)的有機(jī)小分子如膽堿衍生物、醇類、糖類以及尿素等物質(zhì)所形成的溶劑，這些小分子在微生物和動植物細(xì)胞中大量存在[7]。NADES因其環(huán)保、無毒及生物相容性好的特性，廣泛應(yīng)用于天然活性成分的分離萃取。Dai等[8]人發(fā)現(xiàn)紅花中的酚類物質(zhì)在天然低共熔溶劑中具有良好的萃取效果，萃取率在75%～97%。Huang等[9]人研究發(fā)現(xiàn)以氯化膽堿為氫鍵供體合成的天然低共熔溶劑和皂苷協(xié)同作用可以高效去除水稻中的鎘，鎘在人體內(nèi)累積會損害腎臟。另外，生物催化劑在低共熔溶劑中具有高效的催化表現(xiàn)。Xu等[10]人利用Novozyme 435在天然低共熔溶劑中催化合成富含n-3 PUFA的甘油三酯的產(chǎn)率是無溶劑體系下的1.2倍，認(rèn)為以低共熔溶劑作為溶劑是提高合成富含n-3 PUFA的甘油三酯的有效途徑。天然低共熔溶劑不僅能夠提高酶的催化效率，還可以提高酶蛋白的穩(wěn)定性，延長其使用壽命[11]。

目前報道的NADES類型繁多，但仍缺乏可高效篩選對生物大分子具有保護(hù)作用的低共熔體系的方法。綠色熒光蛋白（green flurescent protein，GFP），最初從水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，其熒光活性與結(jié)構(gòu)的變化具有相關(guān)性，可以作為篩選蛋白保護(hù)劑有效的探針蛋白。本文以GFP作為模式蛋白，通過研究GFP在不同類型的NADES中穩(wěn)定性，篩選其中能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的 NADES，為天然活性物質(zhì)的提取和生物催化應(yīng)用提供合適的溶劑。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21用作綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)宿主菌。甜菜堿，氯化膽堿，尿素，甘油，山梨醇和木糖醇購自阿拉丁化學(xué)有限公司（中國上海）。所有其他試劑均為分析級。

1.2 主要儀器

Cytation? 5酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦有限公司；超純水使用 Milli-Q過濾系統(tǒng)（UNIQUE-R20）獲得。

1.3 方法

1.3.1 GFP的表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pET23a-CBD-GFP分別轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21（DE3），涂布Amp抗性的LB平板，過夜長出單克隆。每次從平板挑取單克隆于5 mL LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)12 h，接種于400 mL LB培養(yǎng)基，接種量為1%。待菌液OD600為0.8左右，降溫至20 ℃加終濃度為0.1 mM的IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時間為20 h。經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后，用冷凍離心機(jī)離心（10000 r/min，15 min）發(fā)酵液收集菌體，用PBS緩沖液（20 mM，pH 7.4）重懸菌體，超聲破碎后離心（10000 r/min，25 min）收集上清液，加入磷酸處理過的纖維素吸附CBD-GFP融合蛋白。再用3C蛋白酶消化處理CBD-GFP融合蛋白后，離心（10000 r/min，25 min）分離出GFP蛋白。通過SDS-PAGE電泳檢測GFP的純度，并利用BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海生物生工公司）測定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.2 低共熔溶劑的制備

圖1 天然低共熔溶劑組分的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of NADES component

按照一定摩爾比例稱取氯化膽堿、甜菜堿和氫鍵供體（甘油、尿素、木糖醇和山梨醇）制備天然低共熔溶劑，如表1和圖1所示。兩種固體混合物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在80 ℃溶解0.5～4 h，直至變成透明的液體。制備好的NADES在室溫冷卻后保存在密封容器，存放在干燥器中。

Table 1 Natural deep eutectic solvent used in the experiment

表1 實驗所用的天然低共熔溶劑

1.3.3 熒光檢測

利用酶標(biāo)儀測定GFP的熒光發(fā)射光譜（激發(fā)波長設(shè)定在474 nm）。GFP在不同NADES中于70 ℃孵育10 min，每隔2.5 min取樣（200 μL）。為了監(jiān)測熱失活 GFP的重折疊，將孵育后取的樣品在室溫下放置15 min，每10 s檢測樣品中GFP熒光變化。以初始的熒光強(qiáng)度為100%。

1.3.4 差示掃描量熱法（DSC）分析

DSC分析采用差示掃描量熱儀（NETZSCH DSC 204 F1，德國）。將34 mM的GFP分別溶解于純水、氯化膽堿溶液、山梨醇溶液以及氯化膽堿-山梨醇天然低共熔溶劑后置于鋁盤，放入差示掃描量熱儀中，以10 ℃/min的速率從30 ℃升溫到90 ℃，確定GFP在不同溶劑中的熔點Tm。

1.3.5 脂肪酶活力檢測

將實驗室自制的脂肪酶 AOL酶粉溶解于含水量為40%的CS天然低共熔溶劑中置于45 ℃條件孵育2 h，每隔30 min取樣，在35 ℃和磷酸鹽（20 mM，pH 7）作為緩沖液條件下，以對硝基苯酚辛酸酯為底物，測定脂肪酶AOL的殘留活力。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Origin 8.5軟件作圖并用SPSS 9.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同NADES對GFP熱穩(wěn)定性的影響

圖2 GFP在不同天然低共熔溶劑中的熱變性和復(fù)性Fig.2 Thermal denaturation and renaturation of GFP in various NADES

圖3 GFP在水中和在CS天然低共熔溶劑中的DSC圖譜Fig.3 DSC spectra of GFP in water and CS NADES

膽堿類如甜菜堿，糖類如海藻糖，以及醇類如山梨醇、甘油和木糖醇都是常見的凍干保護(hù)劑，已經(jīng)被證明對生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)具有較好的穩(wěn)定作用，所以被選擇作為天然低共熔溶劑的組分[12]。GFP的熒光與其結(jié)構(gòu)折疊存在相關(guān)性，通過檢測 GFP在不同NADES中的熒光強(qiáng)度來反映其構(gòu)象的變化，揭示不同NADES對GFP熱穩(wěn)定性的影響規(guī)律。結(jié)果如圖2所示，不含NADES的GFP經(jīng)過70 ℃孵育后殘留的相對熒光強(qiáng)度為47%。氯化膽堿-甘油（CG）、氯化膽堿-木糖醇（CX）、甜菜堿-甘油（BG）、甜菜堿-山梨醇（BS）和甜菜堿-木糖醇（BX）這五種低共熔溶劑下的GFP殘留的相對熒光強(qiáng)度為84%～88%。氯化膽堿-山梨醇（CS）對GFP的保護(hù)作用最好，GFP殘留的相對熒光強(qiáng)度為93%。含尿素的NADES對GFP的保護(hù)作用相對較差，GFP的殘留的相對熒光強(qiáng)度為60%。推測是在高溫環(huán)境下，DES中的尿素分子游離出NADES的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而奪取GPF結(jié)構(gòu)中的水分子，影響GFP結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度減弱。Wu等人研究了辣根過氧化物酶分別在 24種低共熔溶劑中的酶活變化，發(fā)現(xiàn)辣根過氧化物酶都能較好的保持其活力

[13]。

將經(jīng)過高溫孵育后的樣品放置在室溫，繼續(xù)檢測GFP的熒光強(qiáng)度變化，研究 GFP結(jié)構(gòu)在緩沖液和NADES中的重折疊現(xiàn)象。由圖2中的復(fù)性過程可知，GFP的結(jié)構(gòu)在NADES和緩沖液中均可發(fā)生一定程度的重折疊過程，但是兩者的效率沒有明顯的差異。

DSC通常用作研究蛋白質(zhì)大分子熱力學(xué)性質(zhì)。為了進(jìn)一步證明CS是否可以增強(qiáng)GFP的耐熱性，利用DSC方法分別測定GFP在CS天然低共熔溶劑和水中的Tm值。Tm值反映了蛋白質(zhì)發(fā)生聚集時的溫度，此時蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)會發(fā)生轉(zhuǎn)變，所以蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性的提高與Tm的增加是密切相關(guān)的[14]。結(jié)果如圖3所示，GFP在CS天然低共熔溶劑中的Tm比在水中的Tm高11 ℃，證實了CS天然低共熔溶劑有利于提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性。Xin等人發(fā)現(xiàn)溶菌酶在含水量為50%的氯化膽堿-海藻糖天然低共熔溶劑中的Tm比水中提高了10.4 ℃[15]。

2.2 NADES含水量對GFP穩(wěn)定性的影響

圖4 不同含水量的CS天然低共熔溶劑以及其單組份對GFP熱穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of CS NADES with various water content and single NADES components on GFP thermal stability

水分對NADES中的氫鍵的有一定的影響，因為水分子會削弱 DES組分之間的相互作用從而破壞NADES的氫鍵網(wǎng)絡(luò)[15,16]。考察GFP在含水量為0%、20%、40%、60%、80%的CS低共熔溶劑以及單組份ChCl和Sorbitol中的熱穩(wěn)定性。如圖4所示，GFP在含水量為20%和40%的CS天然低共熔溶劑中，70 ℃孵育10 min后的殘留的相對熒光強(qiáng)度都在90%左右，而在含水量為60%和80%的相同處理條件下殘留的相對熒光強(qiáng)度為64%和70%。

進(jìn)一步探究低共熔溶劑單組份是否對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性具有類似的保護(hù)作用的影響，研究了GFP在與40%含水量的CS低共熔溶劑相同濃度的單組份氯化膽堿和山梨醇溶液中的熱失活現(xiàn)象。由圖4可知，在70 ℃孵育10 min后，GFP在單組份氯化膽堿和山梨醇溶液中的殘留相對熒光強(qiáng)度分別為55%和62%，高于對照組即在緩沖液中的殘留相對熒光強(qiáng)度，同時低于在含水量為40%的CS天然低共熔溶劑中的殘留相對熒光強(qiáng)度。

2.3 NADES對GFP耐受SDS和H2O2的影響

圖5 SDS（a）和H2O2（b）對于CS天然低共熔溶劑中的GFP穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of SDS(a) and H2O2(b) on the GFP stabilization in presence of CS NADES

除了溫度，化學(xué)試劑如金屬離子、有機(jī)溶劑、氧化物以及表面活性劑對于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性有也影響。為了探究CS低共熔溶劑是否對蛋白質(zhì)耐受化學(xué)物質(zhì)的能力有影響，測定了再加入SDS和H2O2后，在含水量為40%的CS低共熔溶劑中的GFP的熒光變化，對照組為在不加NADES的緩沖液中的GFP。圖5（a）和（b）所示，在1%的SDS中孵育3 min后，GFP的熒光強(qiáng)度沒有發(fā)生降低，而對照組中的GFP的熒光強(qiáng)度在2 min內(nèi)完全喪失，表明CS天然低共熔溶劑具有增強(qiáng)GFP耐受SDS的能力。加入濃度為0.97 M的H2O2的3 min后，在CS低共熔溶劑的GFP殘留原始熒光強(qiáng)度的80%，對照組殘留原始熒光強(qiáng)度的60%，表明在CS天然低共熔溶劑中的GFP耐受H2O2的能力沒有很明顯的提升。

2.4 NADES對脂肪酶AOL熱穩(wěn)定性的影響

圖6 在CS天然低共熔溶劑中的脂肪酶AOL在45 ℃下的熱穩(wěn)定性Fig.6 Incubation of AOL at 45 ℃ in the presence of CS NADES

CS天然低共熔溶劑對GFP具有保護(hù)作用，但對于其他蛋白質(zhì)特別是酶蛋白是否具有相同的保護(hù)效果值得深入探究。脂肪酶是工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的酶制劑，因此選擇來源于米曲霉的脂肪酶AOL作為模式酶，探究其在CS天然低共熔溶劑熱穩(wěn)定性情況。結(jié)果如圖6所示，在45 ℃孵育40 min后，CS天然低共熔溶劑中的脂肪酶AOL殘留活力為60%，而不加低共熔溶劑的脂肪酶AOL的活力在10 min內(nèi)喪失90%，所以CS天然低共熔溶劑同樣對脂肪酶具有保護(hù)作用，能夠提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性，有利于脂肪酶AOL應(yīng)用于生物催化反應(yīng)。

3 結(jié)論

本文以 GFP為模式蛋白，研究了其在不同NADES中的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)了CS天然低共熔溶劑對GFP具有良好的保護(hù)作用，且CS天然低共熔溶劑的含水量會對 GFP熱穩(wěn)定性的影響，含水量為 40%的CS天然低共熔溶劑穩(wěn)定蛋白質(zhì)的效果最好。同時CS天然低共熔溶劑可以提高GFP對SDS的耐受性，對H2O2的耐受性影響不大，同時對脂肪酶AOL具有穩(wěn)定作用。所以CS天然低共熔溶劑不僅對蛋白質(zhì)具有保護(hù)作用，同時對于細(xì)胞系的生長沒有明顯毒副作用，在食品加工及生物催化領(lǐng)域?qū)⒂袕V泛的應(yīng)用前景。