胡唐玲 施高翔 徐志慶 段強(qiáng)軍 邵菁 汪天明 吳大強(qiáng) 汪長中,3

(1.安徽省六安市第二人民醫(yī)院臨床藥學(xué)部，六安 237008;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，合肥 230012;3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012)

抗真菌藥物根據(jù)對真菌作用靶點(diǎn)分為：以細(xì)胞壁為靶點(diǎn)的 (如棘白菌素類)，以細(xì)胞膜為靶點(diǎn)的 (如唑類)和以DNA為靶點(diǎn)的灰黃霉素等。由于人類細(xì)胞無細(xì)胞壁，故基于差異毒力的考慮，以細(xì)胞壁為靶點(diǎn)的抗真菌藥物的研發(fā)往往具有良好的應(yīng)用前景。在臨床上對外陰陰道念珠菌病有顯著療效的中藥復(fù)方白頭翁湯對白念珠菌的菌絲、生物膜等毒力因子有抑制作用[1]。本課題組發(fā)現(xiàn)白頭翁湯的正丁醇提取物 (Butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction，BAEB)抗白念珠菌效果顯著[2]，對是否通過菌體細(xì)胞壁發(fā)揮抗菌作用尚不明確。

1 材料與方法

1.1 菌株

白念珠菌C.albicansSC5314，由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院姜遠(yuǎn)英教授惠贈。

1.2 藥物

白頭翁湯按國家中醫(yī)藥管理局統(tǒng)一組織編審的普通高等類教育中醫(yī)類規(guī)劃教材《方劑學(xué)》中的藥物 (白頭翁、黃柏、黃連、秦皮)組成，購于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)鑒定。白頭翁湯正丁醇提取物的提取方法按照張夢翔等的提取方法，實(shí)驗(yàn)所稱BAEB為其干粉量，實(shí)驗(yàn)中所用BAEB劑量參照張夢翔等所摸索的BAEB劑量[3]；卡泊芬凈 (上海源葉生物科技有限公司)。

1.3 試劑

剛果紅 (CR, solarbio)；熒光白 (CFW, sigma)；一抗小鼠抗β-1,3-葡聚糖IgG (Biosupplies Australia Pty Ltd)；二抗Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠,IgG (abbkine)；0.1%的苯胺藍(lán)溶液工作液 (溶于pH為9.6的甘氨酸緩沖液，solaibio)；PBS緩沖液 (pH7.0±2.0，Leagene)；二甲基亞砜 (國藥集團(tuán))；RPMI-1640培養(yǎng)基 (life technologies公司)；蝸牛酶 (Sigma)。

1.4 儀器

恒溫培養(yǎng)箱 (上海博迅實(shí)業(yè)公司)；倒置熒光顯微鏡 (Olympus IX81，Japan)；流式細(xì)胞儀 (BD AccuriC6)；多功能酶標(biāo)儀 (ABI Spectra Max M2e，美谷分子儀器 (上海)有限公司)；ABI7500熒光定量PCR儀 (美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；透射電子顯微鏡 (EM-1230，JEOL，日本)，切片機(jī) (瑞典，LKB-NOVA型)。

1.5 菌液配制

從4℃保存的YPD培養(yǎng)平板上挑取單菌落白念珠菌，接種至液體沙氏培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至2×106CFU/mL備用。

1.6 Spot assay檢測白念珠菌細(xì)胞活性[4]

從4℃保存的YPD培養(yǎng)平板上挑取單菌落白念珠菌，接種至液體沙氏培養(yǎng)液，37℃搖床中過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至2×106CFU/mL備用。將菌液稀釋成2×105CFU/mL，再按10倍稀釋直至2×101CFU/mL，取100 μL不同濃度菌液分別與100 μL終濃度為0、256、512和1 024 μg/mL的BAEB和終濃度為0.125 μg/mL的陽性對照藥卡泊芬凈混合，依次取5 μL分別點(diǎn)種在固體沙氏培養(yǎng)基上。取100 μL不同濃度菌液分別與100 μL RPMI 1640培養(yǎng)液混合，依次取5 μL分別點(diǎn)種在剛果紅 (100 μg/mL)固體沙氏培養(yǎng)基上和熒光白 (100 μg/mL)固體沙氏培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)48 h后取出，觀察CFU生成情況并拍照。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測白念珠菌細(xì)胞壁中β-1,3-葡聚糖[5-6]

取1 mL (2×106CFU/mL)菌液分別與1 mL終濃度為0、256、512、1 024 μg/mL BAEB和終濃度為0.003 9 μg/mL的卡泊芬凈于6孔板中混合，37℃，培養(yǎng)12 h后，離心收集細(xì)胞，無菌PBS洗滌細(xì)胞三次，用2%BSA的PBS室溫封閉1 h，與一抗4℃孵育過夜，在PBS中嚴(yán)格洗滌除去未結(jié)合的一抗，加入二抗30℃孵育1 h，PBS洗滌細(xì)胞，將沉淀重新懸浮于1 mL無菌水中，用流式細(xì)胞儀BD AccuriC6檢測。

1.8 酶標(biāo)儀檢測白念珠菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖

取1 mL (2×106CFU/mL)菌液分別與1 mL終濃度為0、256、512、1 024 μg/mL BAEB和終濃度為0.003 9 μg/mL的卡泊芬凈于試管中混合，37℃，培養(yǎng)12 h后，離心收集細(xì)胞，無菌PBS洗滌細(xì)胞3次，加入0.1%的苯胺藍(lán)溶液工作液，于80℃避光反應(yīng)15 min，室溫冷卻30 min，吸入96孔板中，用酶標(biāo)儀在398 nm激發(fā)波長和508 nm發(fā)射波長下進(jìn)行熒光測定[7-9]。

由于過去長期存在過量、盲目施肥，導(dǎo)致農(nóng)田土壤板結(jié)、酸化、鹽漬化等問題日益嚴(yán)重。當(dāng)前，農(nóng)業(yè)耕地中有益微生物嚴(yán)重缺失，“土壤修復(fù)”成為涉農(nóng)行業(yè)，尤其是化肥行業(yè)關(guān)注、發(fā)力的新領(lǐng)域。生產(chǎn)環(huán)保、高效、功能的肥料成為化肥生產(chǎn)企業(yè)的新責(zé)任。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測白念珠菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)[6]

取1 mL (2×106CFU/mL)菌液分別與1 mL終濃度為0、256、512、1 024 μg/mL BAEB和終濃度為0.003 9 μg/mL的卡泊芬凈于6孔板中混合，37℃，培養(yǎng)12 h后，離心收集細(xì)胞，無菌PBS洗滌細(xì)胞3次，用4%的甲醛固定40 min，然后用10 mg/L的CFW在37℃染色30 min，用PBS洗滌細(xì)胞3次，用流式細(xì)胞儀BD AccuriC6檢測。

1.10 qRT-PCR檢測細(xì)胞壁生物合成相關(guān)基因的表達(dá)[10]

總RNA的提取 2 mL菌液 (2×106CFU/mL)與2 mL終濃度分別為0、256、512、1 024 μg/mL BAEB混合，37℃孵育6 h后，離心收集菌體，用無菌PBS沖洗3次后進(jìn)行總RNA提取，調(diào)節(jié)RNA濃度，使模板量一致，具體操作方法參照ToyoBo公司MagExtractor-RNA-提取試劑說明書進(jìn)行。

引物的設(shè)計(jì)與合成 基因序列從NCBI獲得，并用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)所需引物，委托上海生工合成引物，各引物情況見表1。

表1 各引物序列表

逆轉(zhuǎn)錄 cDNA 6 μL RNA預(yù)變性 (65℃ 5 min，4℃ 1 min)，后加入混合液 (4×DNA Master Mix 55 μL和gDNA Remover 1.1 μL)2 μL，5RT-Master MixII 2 μL混合后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)完成后將cDNA稀釋10倍備用。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 采用SYBR熒光法，反應(yīng)體系25 μL:2×SYBR Green RealtimePCR 12.5 μL，PCR Forward Primer (10 mol/L)1 μL，PCR Reverse Primer 1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。內(nèi)參基因?yàn)锳CT1每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

定量分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別測定目的基因及內(nèi)參ACT1的Ct值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值,基因表達(dá)水平用倍數(shù)變化來表示 (2-△△Ct法)。

1.11 透射電鏡觀察白念珠菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[7]

取1 mL (2×106CFU/mL)菌液分別與1 mL終濃度為0、256、512、1 024 μg/mL BAEB和終濃度為0.003 9 μg/mL的卡泊芬凈混合，37℃，培養(yǎng)12 h后，離心收集細(xì)胞，取白念珠菌1 mm3大小，置1 mL離心管內(nèi)離心10 min (2 000 r/min)，固定于2.5%戊二醛 (4℃)4～6 h，再固定于1%鋨酸1 h，30%、50%乙醇、70%醋酸鈾乙醇飽和液、80%、95%乙醇、無水乙醇脫水，浸環(huán)氧丙烷30 min，浸環(huán)氧丙烷∶環(huán)氧樹脂1∶1，2 h，環(huán)氧丙烷∶環(huán)氧樹脂1∶2，1 h，浸環(huán)氧樹脂 (Epon812)2 h，入45℃烤箱中12 h，65℃烤箱中48 h，取出包埋好的組織進(jìn)行超薄切片 (片厚70 nm)，將切片水洗后放入醋酸鈾飽和水溶液中染色30 min。雙蒸水洗3次，各15 min，入枸櫞酸鉛染液染色15 min，雙蒸水洗3次各10 min，用日產(chǎn)JEM-1230型透射電鏡觀察。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 BAEB對白念珠菌細(xì)胞活性的影響

和空白對照組 (control)相比，熒光白 (CFW)組、剛果紅 (CR)組、卡泊芬凈組和BAEB干預(yù)組的白念珠菌菌落數(shù)均隨著菌體濃度遞減而逐漸減少，且隨著BAEB濃度的增加，白念珠菌菌落數(shù)逐漸減少，活性降低 (見圖1)。

2.2 BAEB對白念珠菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖的影響

流式細(xì)胞儀檢測用一抗和BAEB干預(yù)后的白念珠菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖結(jié)合，加入二抗擴(kuò)大信號所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。與空白對照組相比，512、1 024 μg/mL BAEB組熒光逐漸增強(qiáng)，且有顯著性差異 (見圖2)。

酶標(biāo)儀檢測苯胺藍(lán)和BAEB作用后的白念珠菌細(xì)胞壁的β-1,3-葡聚糖結(jié)合所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。與空白對照組相比，256、512、1 024 μg/mL BAEB組熒光逐漸增強(qiáng)，且512、1 024 μg/mLBAEB組有顯著性差異 (見圖3)。

2.3 BAEB對白念珠菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)影響

流式細(xì)胞儀檢測CFW和BAEB干預(yù)后的白念珠菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)結(jié)合所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。與空白對照組相比，256、512、1 024 μg/mL BAEB組熒光逐漸增強(qiáng)，且512、1 024 μg/mL BAEB組有顯著性差異 (見圖4)。

2.4 BAEB對白念珠菌細(xì)胞壁合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，256 μg/mL BAEB組FKS1、CHS1、CHS2、CHS3、CHS8分別下調(diào)6.60、1.60、8.48、9.52、9.30倍；512 μg/mL BAEB組FKS1、CHS1、CHS2、CHS3、CHS8分別下調(diào)11.34、9.46、28.32、37.07、20.99倍；1 024 μg/mL BAEB組FKS1、CHS1、CHS2、CHS3、CHS8分別下調(diào)5.57、2.96、3.29、4.47、3.00倍 (見圖5)。

2.5 透射電鏡觀察BAEB干預(yù)后白念珠菌細(xì)胞壁的變化

空白對照組細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較完整，細(xì)胞壁厚度正常。256、512、1 024 μg/mL BAEB組和卡泊芬凈組細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)都有破損，細(xì)胞壁厚度較薄 (見圖6)。

3 討 論

細(xì)胞壁是白念珠菌最外層結(jié)構(gòu)，完整的細(xì)胞壁呈剛性結(jié)構(gòu)，可以作為物理化學(xué)屏障保護(hù)細(xì)胞，并可以調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。白念珠菌細(xì)胞壁主要組分是多糖，包括β-葡聚糖、幾丁質(zhì)、甘露聚糖等，其中最外層大多是甘露聚糖和甘露糖蛋白，β-葡聚糖和幾丁質(zhì)則構(gòu)成細(xì)胞壁的骨架[11]。白念珠菌感染時(shí)，正是通過其細(xì)胞壁的主要組分與宿主細(xì)胞上相應(yīng)受體的相互作用介導(dǎo)對靶細(xì)胞的損傷。因此，研究針對細(xì)胞壁的抗白念珠菌藥物對于防治白念珠菌感染具有重要意義。

熒光白 (CFW)、剛果紅 (CR)、卡泊芬凈均是真菌細(xì)胞壁抑制劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和空白對照組 (control)相比，含CFW、CR、卡泊芬凈培養(yǎng)基上的白念珠菌菌落明顯減少；在含BAEB的培養(yǎng)基上，隨著BAEB濃度遞增，白念珠菌菌落逐漸減少，表明BAEB對白念珠菌活性也有抑制作用。

圖1BAEB對白念珠菌細(xì)胞活性的影響圖2抗β-1,3-葡聚糖抗體與β-1,3-葡聚糖結(jié)合的熒光強(qiáng)度 (**P<0.01)圖3苯胺藍(lán)與β-1,3-葡聚糖結(jié)合熒光的強(qiáng)度 (*P<0.05；**P<0.01)圖4CFW與幾丁質(zhì)結(jié)合熒光的強(qiáng)度 (*P<0.05；**P<0.01)圖5qRT-PCR法檢測BAEB對白念珠菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖及幾丁質(zhì)生物合成相關(guān)基因表達(dá)的影響 (*P<0.05)

Fig.1Effect of BAEB on activity ofCandidaalbicansFig.2Fluorescence intensity of anti-β-1,3-glucan antibody binding to β-1,3-glucan (**P<0.01)Fig.3Fluorescence intensity of aniline blue combine β-1,3-glucan (*P<0.05; **P<0.01)Fig.4Fluorescence intensity of CFW combine chitin (*P<0.05; **P<0.01)Fig.5The effects of BAEB on β-1,3-glucan and chitin biosynthesis related gene expression inCandidaalbicanscell wall by qRT-PCR (*P<0.05)

流式細(xì)胞術(shù)檢測到，用Cy3標(biāo)記的二抗和一抗 (即抗β-1,3-葡聚糖抗體)結(jié)合后，隨著BAEB濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。苯胺藍(lán)和白念珠菌β-1,3-葡聚糖特異性結(jié)合，顯示熒光[11]，酶標(biāo)儀檢測顯示，隨著BAEB濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。CFW和白念珠菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，可以顯示熒光[12]，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，隨著BAEB濃度的增加，熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)。上述結(jié)果表明，BAEB干預(yù)后，有可能破壞了白念珠菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性 (integrity)，從而增加了β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)的暴露。從宿主-病原體相互作用角度來說，宿主固有免疫細(xì)胞表面的模式識別受體 (PRR)既可以識別白念珠菌表面的甘露聚糖和甘露糖蛋白，也可以識別白念珠菌細(xì)胞壁暴露的內(nèi)層的β-葡聚糖和幾丁質(zhì)，而Dectin-1即為β-1,3-葡聚糖的高親和性受體，可介導(dǎo)識別和吞噬白念珠菌[13-14]。因此，藥物作用所導(dǎo)致的白念珠菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)的暴露在誘導(dǎo)抗真菌免疫應(yīng)答中發(fā)揮了潛在的重要作用。

通過抑制或干擾白念珠菌細(xì)胞壁成分的生物合成能有效地抑制或殺滅真菌。FKS1是白念珠菌葡聚糖合酶調(diào)控基因[15-16]，CHS1,2,3,8是白念珠菌幾丁質(zhì)合酶相關(guān)基因[17-20]。qRT-PCR檢測顯示，BAEB干預(yù)后均能使這些基因下調(diào)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P<0.05)，表明BAEB可能會抑制白念珠菌細(xì)胞壁葡聚糖和幾丁質(zhì)的生物合成。

TEM可直接觀察白念珠菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性?？瞻讓φ战M白念珠菌的細(xì)胞壁厚度正常，結(jié)構(gòu)完整，而256、512、1 024 μg/mL BAEB組細(xì)胞壁厚度變薄，并且結(jié)構(gòu)有破損，提示BAEB可以破壞細(xì)胞壁而損傷白念珠菌。

本研究顯示，BAEB既能通過影響白念珠菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性引起β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)的暴露，也能抑制β-1,3-葡聚糖合酶、幾丁質(zhì)合酶生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，因此表明BAEB能從多個(gè)角度靶向細(xì)胞壁進(jìn)而抑制白念珠菌，為白念珠菌病治療提供可靠的依據(jù)。

圖6BAEB對白念珠菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響 (每組左圖為30 000×，右圖為50 000×)：A.空白對照組；B.256 μg/mL BAEB；C.512 μg/mL BAEB；D.1 024 μg/mL BAEB；E.0.00 39 μg/mL卡泊芬凈

Fig.6Candidaalbicanscell wall structure after BAEB intervention (the left picture of each group is magnified by 30 000× and the right picture is magnified by 50 000×): A.control; B.256 μg/mL BAEB; C.512 μg/mL BAEB; D.1 024 μg/mL BAEB; E.0.003 9 μg /mL caspofungin