孟玲寧 劉錦燕 趙悅 呂婕 林伊靜 項(xiàng)明潔

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗(yàn)科，上海 200020；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025)

1 PPTase概述

生物體中大量存在PPTase，且它們在蛋白結(jié)構(gòu)上有所差異，其主要功能即參與啟動脂肪酸、聚酮化合物及非核糖體肽的合成。在1996年，就已有5個不同實(shí)驗(yàn)室通過生物信息學(xué)鑒定出了許多PPTase。現(xiàn)PPTase被分為3類。Ⅰ型PPTase即"AcpS"型 (見圖1a)，該型在20世紀(jì)60年代后期對大腸桿菌進(jìn)行研究時被首次發(fā)現(xiàn)，并隨后通過對植物的研究，從真核生物中得以分離，為PPTase中最為常見的一種。其主要功能是催化FAS、PKS等初級代謝合成酶中的ACP的輔基化，且在三聚體形態(tài)時發(fā)揮作用 (見圖1a)。Ⅱ型PPTase即"Sfp"型 (見圖1b)，其代表Sfp在20世紀(jì)90年代初期被Grossman等發(fā)現(xiàn)，他們研究鑒定出了大腸桿菌與枯草芽孢桿菌的鐵載體腸細(xì)菌素和枯草菌脂蛋白生物合成的基因，并把它們分別命名為entD和Sfp，它在菌體內(nèi)參與賴氨酸的合成，活化α-氨基己二酸還原酶 (α-Aminoadipate reductase, α-AAR)，并具有激活PKS和NRPS的功能 (見圖1)。Ⅲ型PPTase則是融合在PKS或FAS上的一個結(jié)構(gòu)域，也被稱為結(jié)構(gòu)域型，其發(fā)現(xiàn)相對較少，它能特異性催化同一個多肽鏈中的ACP的輔基化，且功能通常不能被其他PPTase替代[1]。

圖1枯草芽孢桿菌的兩種酶——AcpS (a)和Sfp (b)的頂視結(jié)構(gòu)圖[2]

Fig.1Fungal hyphae under microscopy

由此可見，PPTase的主要功能即催化FAS、PKS和NRPS中ACP和PCP的翻譯后修飾反應(yīng)，修飾包括將CoA的4-磷酸泛酸巰基乙胺部分共價連接到存在于PKS和NPRS中的所有酰基載體和肽基載體結(jié)構(gòu)域中保守的絲氨酸上，從而使ACP和PCP從無活性變?yōu)橛谢钚?，啟動脂肪酸、聚酮化合物和非核糖體肽的合成[3-4]。

PKs及NRPs能夠影響生物的生長和繁殖，激活其合成的PPTase在不同物種中擁有不同的結(jié)構(gòu)，類型也不盡相同。因此，PPTase可能成為一種新的藥物研發(fā)靶點(diǎn)。

2 PPTase在真菌中的研究進(jìn)展

在真菌中，PPTase作用于PKS與NRPS途徑產(chǎn)生生物活性化合物，如參與賴氨酸的生物合成、聚酮化合物的合成、對鐵離子的吸收等等過程，可能參與致病[5]。真菌的次級代謝產(chǎn)物PKs以及NRPs現(xiàn)被發(fā)現(xiàn)往往與其對人或?qū)χ参锏闹虏∮嘘P(guān)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)大量不同PKSs及NRPSs的存在，它們的結(jié)構(gòu)與功能都十分多樣。例如，在對人體致病的真菌 (如煙曲霉)中，PK派生的黑色素能增加其毒力，而在對植物致病的真菌中，PKSs所合成的毒素也能加強(qiáng)其毒性。一部分菌中的NRPSs也參與毒素合成、鐵載體合成等，同樣與真菌的致病有關(guān)[6-8]。盡管PKSs與NRPSs十分多樣且與致病一定程度上相關(guān)，但它們中的大部分都需要PPTase所控制的翻譯后修飾反應(yīng)來活化，若把部分真菌中的PPTase敲除，該菌也可能會因?yàn)闊o法合成賴氨酸而無法生長。由此可見，PPTase可以被認(rèn)為是一種真菌致病因子，并與真菌生長密切相關(guān)，且因?yàn)槟壳跋嚓P(guān)研究較少，從而開拓了一種制備抗真菌藥的新思路。

2.1 PPTase在真菌中的分型

現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的真菌基因組中的PPTase分為3型：①Ⅰ型PPTase：此酶在反應(yīng)過程中是三聚體形態(tài)而非單體形態(tài)，最早在枯草芽孢桿菌中被發(fā)現(xiàn)，為"AcpS"型，在天藍(lán)鏈霉菌也發(fā)現(xiàn)有該酶。該酶具有三聚體四級結(jié)構(gòu)，每種單體約15 kDa，三聚體蛋白中的每一個單體都有一個活性中心，在活性中心含有Mg2+和焦磷酸鹽結(jié)合的位點(diǎn)。②Ⅱ型PPTase：僅有兩種Ⅱ型PPTase已被解析，分別是來自枯草芽孢桿菌的Sfp15與來自人類的α-氨基己二酸半醛脫氫酶 (α-aminoadipate semialdehyde dehydrogenase，AASDHPPT)。與AcpS型不同的是，Sfp型PPTase表現(xiàn)出假二聚體折疊，由兩個結(jié)構(gòu)相似的以短多肽環(huán)連接的亞結(jié)構(gòu)域組成，AASDHPPT與Sfp15的Mg2+殘基數(shù)不相同，前者有2個而后者有3個。③Ⅲ型PPTase：Ⅲ型PPTase融合在PKS或FAS上，在發(fā)揮作用時，與Ⅰ型PPTase相似，也是形成三聚體形態(tài)，同時它也與Ⅱ型PPTase一樣有3個Mg2+結(jié)合殘基。值得一提的是，在真菌中不同類型PPTase各司其職，有其不同功能，而在細(xì)菌中可能只擁有一種PPTase，并同時兼顧各種功能?，F(xiàn)今在人類基因組中只鑒定出一種廣譜的PPTase，其功能為翻譯后修飾胞漿中及線粒體中的FAS系統(tǒng)中的ACP組件與氨基己二酸半醛脫氫酶，后者與賴氨酸降解有關(guān)。這種在人體內(nèi)鑒定出的PPTase最接近Sfp型即Ⅱ型PPTase，而真菌線粒體PPTase，例如煙曲霉中的PPTB，則更類似于結(jié)構(gòu)截然不同的AcpS型即Ⅰ型PPTase[9]。這就提示我們可以尋找針對真菌線粒體PPTase的特異性的靶點(diǎn)，從而能夠做到殺滅真菌且不對人體造成傷害。并且，PPTase有合成大量PKSs和NRPSs的“開關(guān)”作用，因此以PPTase為靶點(diǎn)來制造抗真菌藥物可能可以有效阻斷其大部分次級代謝產(chǎn)物的合成，從而高效地降低致病真菌的毒力，起到治療的作用。

2.2 PPTase在真菌中的功能作用

PPTase在真菌中對于脂肪酸和賴氨酸的生物合成以及催化許多具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物的生成是必不可少的，它也是真菌初級代謝和特化代謝中的各種其他中央生物合成途徑的必需物質(zhì)[5]。目前，對于真菌中各型PPTase的功能作用的研究較少，部分機(jī)制尚且不明。已知Ⅰ型PPTase能夠?qū)oA和apo-ACP反應(yīng)進(jìn)行催化，生成holo-ACP和3',5'-二磷酸核苷酸，同時該反應(yīng)也需要Mg2+或Mn2+等金屬離子[10]。

現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母中，胞質(zhì)脂肪酸、線粒體FAS和α-氨基乙二酸-半醛脫氫酶這3種物質(zhì)分別需要3種特定PPTase的激活，這3種PPTase分別為：Ⅰ型PPT酶FAS2，Ⅲ型PPT酶PPT2以及Ⅱ型PPT酶Lys5。其中，F(xiàn)AS2主要起到胞質(zhì)脂肪酸合成酶的修飾作用；PPT2主要與硫辛酸的合成有關(guān)，而硫辛酸是一種線粒體輔助因子，是線粒體呼吸的必需物質(zhì)；Lys5則參與賴氨酸的生物合成，賴氨酸是真菌生長所必須的物質(zhì)[11]。

2.3 PPTase對真菌生長的影響

PPTase的存在對于真菌來說可能是一種重要影響條件。研究發(fā)現(xiàn)若將白念珠菌的一個PPT2等位基因C1_09480W敲除，并將另一個PPT2等位基因置于可調(diào)節(jié)啟動子MET3下，就可以發(fā)現(xiàn)在同等條件下被敲除株無法生長，即表明PPT2在白念珠菌的生長中必不可少[12]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在構(gòu)巢曲霉中，存在單一Sfp型PPTase，即NpgA。該酶被認(rèn)為負(fù)責(zé)激活構(gòu)巢曲霉中所有PKSs以及NRPSs (除α-AAR)[13-14]。若將構(gòu)巢曲霉的NpgA基因敲除，則其突變體在缺乏賴氨酸及部分NRPS產(chǎn)物的情況下無法生長[15]。另有學(xué)者YUEQIANG LENG與SHAOBIN ZHONG構(gòu)建了育旋孢腔菌 (Cochliobolussativus)的ΔPPT1敲除株，即將菌中的PPT1基因敲除，通過給予不同的環(huán)境并在不同營養(yǎng)程度的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，他們發(fā)現(xiàn)敲除這段基因會導(dǎo)致育旋孢腔菌對賴氨酸營養(yǎng)缺陷，并無法產(chǎn)生黑色素，且對鐵的消耗以及過氧化氫的敏感度升高，也對菌株的毒力造成了損失[16]。其中，賴氨酸的合成對于育旋孢腔菌以及一部分真菌的生長都是必須的，在敲除株無法由AAR途徑合成賴氨酸且外界也不提供賴氨酸的情況下，該菌株幾乎無法生長。綜上，PPTase在真菌合成代謝中起著至關(guān)重要的作用，若將其敲除，則會對阻斷其次級代謝，對其生長及致病產(chǎn)生影響。

3 PPTase在細(xì)菌中的研究進(jìn)展

PPTase在細(xì)菌中的功能與其在真菌中的功能較為相似，主要為調(diào)控翻譯后修飾反應(yīng)，把控PKSs和NRPSs的激活?，F(xiàn)已知的許多次級代謝產(chǎn)物均來自于細(xì)菌，包括色素、鐵載體和抗生素等。這些物質(zhì)會在環(huán)境相對苛刻的情況下為細(xì)菌增強(qiáng)適應(yīng)性，而催化產(chǎn)生這些具有部分保護(hù)作用次級代謝產(chǎn)物的源頭酶便是PPTase[2]。Ⅰ型PPTase首次在大腸埃希菌中被發(fā)現(xiàn)，之后Grossman等在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)了與Ⅰ型PPTase結(jié)構(gòu)有很大差別的另一種PPTase，該酶與合成腸桿菌素轉(zhuǎn)體載體有關(guān)，并被命名為EntD[17-18]。同時，他們也發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌中的同類型PPTase，并把這類PPTase都?xì)w為Ⅱ型PPTase。現(xiàn)今的研究表明，正常情況下細(xì)菌中會有至少一個I型PPTase與Ⅱ型的PPTase (獨(dú)有一種PPTase的情況下以Ⅰ型PPTase居多，也存在少數(shù)細(xì)菌體內(nèi)僅有一個Ⅱ型PPTase)。在PseudomonasaeruginosaPAO1 (PcpS)與Synechocystissp.Strain PCC6803 (Sppt)等菌中就只有一個PPTase[10,19]。這可能表明在細(xì)菌中，僅有的這一種PPTase既需要催化次級代謝，也需要催化初級代謝中ACP的輔基化，這與真菌中的情況不同。一部分細(xì)菌的Sfp型PPTase被證實(shí)可以彌補(bǔ)其他菌種的賴氨酸合成缺陷，且這類Sfp型PPTase因?yàn)槟苄揎棾跫壟c次級代謝中絕大部分Acps而被受到關(guān)注，大腸埃希菌的EntD PPTase便是其中的一個。目前，在細(xì)菌中進(jìn)行的關(guān)于PPTase基因敲除以及其特殊作用的研究尚不充分，可能是一個較新穎的研究方向。

4 總 結(jié)

PPTase在大量不同生物體中存在，且主要起到合成FAS、PKS、NRPS等次級代謝產(chǎn)物的作用。近幾年來，對于PPTase各方面的研究逐漸增多。Wiemann、Albermann等[20]發(fā)現(xiàn)異源性子囊菌 (Fusariumfujikuroi)造成水稻病的罪魁禍?zhǔn)资瞧銹KS與NRPS產(chǎn)生的部分次級代謝產(chǎn)物，PKS與NRPS又被該菌內(nèi)一種Sfp型的PPTase所翻譯后修飾，同時該酶也與賴氨酸合成有關(guān)。他們制作了突變株后發(fā)現(xiàn)若該酶的基因缺失，則異源性子囊菌無法致病。Gerc與Stanley-Wall[21]也證實(shí)了粘質(zhì)沙雷菌重要代謝物的產(chǎn)生與其PPTase即PswP有關(guān)。除了關(guān)于具體菌株內(nèi)PPTase的研究， Kosa、Foley等[22]學(xué)者也嘗試在各種細(xì)菌內(nèi)尋找PPTase抑制劑，并利用熒光技術(shù)來監(jiān)測抑制劑在人體內(nèi)的作用。若抑制劑能夠投入使用，則可以一定程度上避免使用抗生素時會產(chǎn)生耐藥性的副作用。另有Bunet、Riclea等[23]對特定細(xì)菌的基因組進(jìn)行分析，對PPTase的不同編碼基因及其功能進(jìn)行研究。在真菌中，PPTase可能參與致病，輔助合成對人或?qū)χ参镏虏〉奈镔|(zhì)。且將真菌中的PPTase敲除可能會抑制賴氨酸合成，從而阻止真菌生長。因此可考慮發(fā)展該酶為一種新的抗真菌藥靶點(diǎn)。在細(xì)菌中，PPTase功能與在真菌中相似，并可一種酶“身兼多職”，同時擁有真菌中幾種PPTase的能力。對PPTase的研究應(yīng)更深入更廣泛地進(jìn)行，來達(dá)到用創(chuàng)新思路制作藥物，而更有效地抑制疾病的目的。