于淑穎 張麗 李穎 徐英春

(1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科侵襲性真菌病機制研究與精準診斷北京市重點實驗室，北京 100730；2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院，北京 100730)

隨著罹患自身免疫病、艾滋病、腫瘤等惡性疾病患者數(shù)量的不斷增多，侵襲性曲霉病在臨床的發(fā)病率也逐年升高[1]。根據(jù)2008年美國感染病協(xié)會(IDSA)公布的曲霉病治療指南，對于侵襲性肺曲霉病，尤其是威脅生命的嚴重感染，首選唑類抗真菌藥物。但是隨著唑類抗真菌藥物的推廣應用，曲霉對其耐藥的報道逐漸增多，且曲霉對氟康唑和酮康唑呈現(xiàn)天然耐藥[2]。

卡泊芬凈(caspofungin)是新型棘白菌素類抗真菌藥物，通過非競爭性抑制1,3-β-D葡聚糖的合成、破壞真菌細胞壁的完整性來發(fā)揮抗真菌作用。2001年，卡泊芬凈(默沙東公司，商品名科賽斯)獲得了美國食品藥物管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)的許可，全球范圍內(nèi)用于念珠菌病、不明原因的中性粒細胞減少性發(fā)熱患者的經(jīng)驗性抗真菌治療和(脂質(zhì)體)兩性霉素B和(或)伊曲康唑治療無效或不能耐受的侵襲性曲霉病[3]。卡泊芬凈對曲霉菌屬(包括煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、土曲霉和白曲霉)具有很好的體外活性[4]。

本研究就中國江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)仿制藥卡泊芬凈(商品名卡凈，以下稱國產(chǎn)卡泊芬凈)對侵襲性曲霉菌的體外抗真菌藥物敏感性，與進口卡泊芬凈(默沙東公司，商品名科賽斯，以下稱進口卡泊芬凈)進行對比，評估國產(chǎn)和進口卡泊芬凈體外抗真菌活性的一致性。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源 本研究選取北京協(xié)和醫(yī)院2014-2016年呼吸道、血液、腹腔等部位分離的37株煙曲霉、15株黃曲霉、10株黑曲霉、5株土曲霉、4株構(gòu)巢曲霉以及日本曲霉、塔賓曲霉、溜曲霉和聚多曲霉各1株，共計75株。

質(zhì)控菌株 近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6528為標準菌株。

試劑與儀器 本研究所用藥物，國產(chǎn)卡泊芬凈(中國江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，商品名卡凈，0.5 g/瓶)，進口卡泊芬凈(美國默沙東公司，商品名科賽斯，0.5 g/瓶)，米卡芬凈(中國安斯泰來制藥有限公司，商品名米開民，0.5 g/瓶)，泊沙康唑(美國默沙東公司，商品名諾科飛，混懸液，5 mL：200 mg)；氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑和兩性霉素B標準品從中國食品藥品檢定研究院購買。科馬嘉顯色培養(yǎng)基(法國科馬嘉公司)；沙堡弱培養(yǎng)基(英國OXOID公司)；RPMI1640培養(yǎng)基，含谷氨酰胺不含碳酸氫鹽并以酚紅為指示劑，使用0.165 mol/L MOPS緩沖液調(diào)pH7.0±0.1(德國sigma-aldrich公司)；無菌U型96孔板(江蘇省海門盛泰實驗器材廠)；全自動加樣儀器Sentititre AIM(賽默飛世爾科技公司)。

1.2 方法

VITEK MS 入組菌株采用VITEK MS進行鑒定，菌落均勻涂布在靶板上，滴加1μL基質(zhì)，待干燥后放入機器采集峰圖，與數(shù)據(jù)庫中的峰圖比對得出鑒定結(jié)果及鑒定率，具體操作遵照儀器使用說明書?？尚哦却笥?0%，認為鑒定至種水平。

基因測序 通過鈣調(diào)蛋白基因擴增和測序進行進一步鑒定，所有菌株均鑒定至種的水平[1]。采用試劑盒純化方法，根據(jù)說明書提取曲霉菌DNA，將DNA產(chǎn)物送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果在GenBank網(wǎng)站上進行比對。

藥敏試驗 嚴格按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)M38推薦的微量液基稀釋法[5]，平行測試卡泊芬凈(0.008～8 μg/mL)、國產(chǎn)卡泊芬凈(0.008～8 μg/mL)、米卡芬凈(0.008～8 μg/mL)、泊沙康唑(0.015～16 μg/mL)、伊曲康唑(0.015～16 μg/mL)、伏立康唑(0.015～16μg/mL)和兩性霉素B(0.015～16 μg/mL)。

數(shù)據(jù)分析 根據(jù)MEC/MIC值計算MEC/MIC范圍、MEC50/MIC50、MEC50/MIC90和幾何均數(shù)(GM)，結(jié)果判讀以CLSI M59推薦折點為判斷標準，米卡芬凈的結(jié)果判讀參照Li等研究者的推薦[6, 7]，比較兩種卡泊芬凈藥敏檢測結(jié)果間的一致性及8種抗菌藥物的抗菌活性。兩種卡泊芬凈的一致性通過分類一致性(極大錯誤、大錯誤和小錯誤的發(fā)生率)以及基本一致性進行評價。分類一致性(categorical agreement， CA)指待測藥物與參考藥物判讀結(jié)果的一致性，如二者均判讀為敏感、中介或耐藥[8]。實質(zhì)一致性(essential agreement, EA)指被待測藥物檢測MIC值與參考藥物相差不超過1個稀釋倍數(shù)[9]。

2 結(jié) 果

2.1 菌種鑒定結(jié)果

以鈣調(diào)蛋白基因測序結(jié)果為“金標準”，VITEK MS的結(jié)果顯示無法鑒定出塔賓曲霉和溜曲霉，并將日本曲霉錯誤鑒定為黑曲霉，造成這種現(xiàn)象的原因是由于VITEK MS數(shù)據(jù)庫中不包含上述3種菌種。除此之外，VITEK MS將其余72株曲霉菌均正確鑒定至種水平。

2.2 7種抗真菌藥物對75株曲霉臨床分離株的抗菌活性

表1顯示7種抗真菌藥物對75株曲霉臨床分離株的抗真菌活性，總體來看，全部抗真菌藥物對絕大多數(shù)菌株具有較低的MIC或MEC值，棘白菌素類藥物的MEC值總體低于唑類藥物的MIC值，而米卡芬凈對全部曲霉菌株的MEC50和MEC90比卡泊芬凈低出2個梯度。唑類藥物中，伊曲康唑MIC50和MIC90(1 μg/mL和2 μg/mL)最高，高于伏立康唑(0.5 μg/mL和1 μg/mL)和泊沙康唑(0.12 μg/mL和0.5 μg/mL)。兩性霉素B對98.7%的菌株(74/75株)的MIC值≤2 μg/mL，只有1株黃曲霉的MIC值為4 μg/mL。

除了伊曲康唑(敏感率59.5%)，37株煙曲霉對其他抗真菌藥物的敏感率均高達100%。黃曲霉和黑曲霉中也觀察到類似的結(jié)果，15株黃曲霉和10株黑曲霉對伊曲康唑的敏感率分別為93.3%和60%。相較于其他菌種，兩性霉素B對黃曲霉的MIC值更高，MIC50和MIC90分別為2 μg/mL和4 μg/mL。綜合來看，國產(chǎn)卡泊芬凈和進口卡泊芬凈具有相同的MEC范圍、MEC50和MEC90。但是分菌種來看，國產(chǎn)卡泊芬凈對煙曲霉的MEC50(0.03 μg/mL)低于進口卡泊芬凈(0.06 μg/mL)；國產(chǎn)卡泊芬凈對土曲霉的MEC90(≤0.008 μg/mL)低于進口卡泊芬凈(0.015 μg/mL)；國產(chǎn)卡泊芬凈對其他不常見曲霉的MEC50和MEC90(均為0.015 μg/mL)低于進口卡泊芬凈(均為0.03 μg/mL)。

2.3 國產(chǎn)卡泊芬凈和進口卡泊芬凈藥敏測定結(jié)果間的一致性分析(見表2)

兩種卡泊芬凈對曲霉抗菌藥物敏感性結(jié)果的分類一致性和實質(zhì)一致性均高達100%。國產(chǎn)卡泊芬凈和進口卡泊芬凈僅對11株曲霉菌的MEC值存在不一致，包括8株煙曲霉、1株黃曲霉、1株土曲霉和1株塔賓曲霉，且國產(chǎn)卡泊芬凈對上述菌株的MEC值僅較進口卡泊芬凈低一個濃度梯度?？傮w來說，兩種卡泊芬凈對曲霉菌體外藥敏測定結(jié)果高度一致。

表1 7種抗真菌藥物對75株曲霉臨床分離株的抗菌活性

(續(xù)表)

表2 兩種卡泊芬凈對75株曲霉菌的MEC值的比較以及一致性評價

2.4 棘白菌素類藥物24 h和48 h藥敏測定結(jié)果的一致性分析(見表3)

卡泊芬凈和米卡芬凈對超過76%的曲霉菌24 h和48 h的藥敏測定結(jié)果完全一致。48 h時，國產(chǎn)卡泊芬凈和進口卡泊芬凈分別對4株曲霉菌的MEC結(jié)果較24 h高出2個濃度梯度，分別對10株和14株曲霉菌高出1個濃度梯度。米卡芬凈對曲霉菌24 h和48 h的藥敏測定結(jié)果間具有最高的一致性，僅有7株曲霉菌相差1個濃度梯度。

表3棘白菌素類藥物對75株曲霉菌24 h和48 h藥敏測定結(jié)果的一致性分析 (n)

Tab.3Comparison of 24h and 48h MEC values of echinocandins against 75Aspergillusisolates

藥物棘白菌素類藥物對曲霉菌24 h和48 h MEC結(jié)果相差梯度株數(shù)比較0+1濃度梯度+2濃度梯度卡泊芬凈(國產(chǎn))61104卡泊芬凈(進口)57144米卡芬凈6870

3 討 論

曲霉菌是環(huán)境中廣泛存在的條件性致病真菌，可引起人類的過敏性、慢性或者侵襲性曲霉病。侵襲性曲霉病是曲霉菌感染最嚴重的一種類型，主要累及免疫功能缺陷的患者，在免疫缺陷患者中具有很高的發(fā)病率和死亡率[10]。從全球范圍來看，煙曲霉是造成侵襲性曲霉病最常見的致病菌，超過90%的侵襲性曲霉病是由煙曲霉引起的，其次是黃曲霉、黑曲霉和土曲霉。唑類藥物是曲霉病治療最主要的一線藥物，然而，曲霉的唑類藥物耐藥現(xiàn)象已經(jīng)成為刻不容緩的全球問題[11]?？ú捶覂艟哂胁煌谶蝾愃幬锏莫毺刈饔脵C制，大量體外試驗的證據(jù)表明卡泊芬凈產(chǎn)生耐藥性的可能性極低[12]。

本研究結(jié)果表明，棘白菌素類藥物對曲霉菌臨床分離株展現(xiàn)了很高的體外抗真菌活性，米卡芬凈的體外抗真菌活性又高于卡泊芬凈，這一結(jié)果與Pfaller等[13]研究者的報道一致。根據(jù)CLSI規(guī)定的流行病學折點(epidemiological cutoff values, ECVs)進行判讀，本研究全部菌株對伏立康唑和泊沙康唑均敏感，但是分別有16株煙曲霉、2株黃曲霉和5株黑曲霉對伊曲康唑耐藥。這一現(xiàn)象的原因可能可以用Prigitano等的研究進行解釋：近年來，大量農(nóng)業(yè)唑類抗真菌劑的廣泛使用導致了環(huán)境耐藥菌株的產(chǎn)生，其主要的耐藥機制為Cyp51A基因上游啟動子出現(xiàn)TR34/L98H突變，而這一突變主要與伊曲康唑的耐藥高度相關(guān)，與伏立康唑和泊沙康唑的抗菌敏感性沒有明確關(guān)系[11]。這一結(jié)果也提示我們加強對臨床和環(huán)境曲霉菌的抗真菌耐藥監(jiān)測，尋找替代殺菌劑，對減少因使用農(nóng)業(yè)唑類抗真菌劑而產(chǎn)生的耐藥至關(guān)重要。

已有報道表明兩性霉素B對土曲霉具有較高的MIC值[14]，本研究中兩性霉素B對5株土曲霉的MIC50和MIC90的分別為0.5 μg/mL和1 μg/mL，未觀察到較高的MIC值，可能是由于菌株數(shù)量有限。值得注意的是，本研究中兩性霉素B對15株黃曲霉菌株的MIC50和MIC90分別為2 μg/mL和4 μg/mL，明顯高于其他菌種，因此，臨床工作中對曲霉菌進行藥敏試驗對于合理治療至關(guān)重要。

不同于曲霉菌加入唑類藥物和兩性霉素B后， 35℃孵育48 h再讀取其MIC值，CLSI推薦曲霉菌加入棘白菌素類藥物后，35℃孵育24 h即可讀取其MEC值，即與單純曲霉生長對照孔的菌絲相比，顯微鏡下開始觀察到菌絲變短、變粗和高度分叉改變的最低藥物濃度[5]。本研究對卡泊芬凈和米卡芬凈24 h和48 h藥敏測定結(jié)果的一致性進行了比較，發(fā)現(xiàn)卡泊芬凈對超過76%的曲霉菌24 h和48 h的藥敏測定結(jié)果完全一致，而米卡芬凈的一致性更高(90.7%)。

此外，本研究顯示受試菌體外對國產(chǎn)卡泊芬凈與進口卡泊芬凈的敏感性高度一致，國產(chǎn)卡泊芬凈與進口卡泊芬凈對37株曲霉菌的MEC值中，僅11株菌的MEC值存在不一致，且僅相差一個濃度梯度，無極大錯誤、大錯誤和小錯誤的發(fā)生。因此，兩種卡泊芬凈對曲霉體外藥敏測定結(jié)果高度一致。而且國產(chǎn)卡泊芬凈對煙曲霉、土曲霉和其他少見曲霉的體外抗真菌活性可能優(yōu)于進口卡泊芬凈。

綜上所述，相較于唑類藥物和兩性霉素B，卡泊芬凈對曲霉具有較好的體外抗真菌活性，且國產(chǎn)卡泊芬凈與進口卡泊芬凈的體外抗菌活性高度一致。