張生彬，劉寶琴，董長城，李冰

(內蒙古包鋼醫(yī)院 肝膽外科，內蒙古 包頭 014010)

膽囊癌是膽道系統(tǒng)惡性腫瘤中最常見的一種，約占膽道系統(tǒng)腫瘤的2/3，但由于其病因尚未完全明確，缺少特異性的臨床表現(xiàn)，病情也很隱匿，因此，一旦確診為膽囊癌，患者的病情多已發(fā)展到中晚期，且大部分都已發(fā)生局部浸潤或組織轉移[1- 2]。腫瘤產生和發(fā)展的重要標志之一為細胞凋亡過程發(fā)生紊亂，腫瘤細胞凋亡受到抑制也是腫瘤對放化療不敏感的因素之一，因此，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡是腫瘤治療的機制之一[3- 4]。凋亡途徑分為外源性途徑和內源性途徑，B淋巴細胞瘤2(B- cell lymphoma 2, Bcl- 2)和髓樣細胞白血病- 1(myeloid cell leukemia- 1,Mcl- 1)作為抗凋亡蛋白參與內源性凋亡途徑[5]。在細胞學上，膽囊癌的進展過程是細胞增殖和凋亡因子表達失調的結果。在膽囊癌細胞中，抗凋亡因子Bcl- 2、Mcl- 1和B淋巴細胞瘤xL(B- cell lymphoma extra large, Bcl- xL)均呈現(xiàn)過度表達，促凋亡因子Bcl- 2相關X蛋白(Bcl- 2 assaciated X protein, Bax)和Bcl- 2激活抑制蛋白(Bcl- 2 homologous antagonist killer, Bak)均呈現(xiàn)低表達，抗凋亡因子可通過其BH3結構域與促凋亡因子形成異二聚體而保護癌細胞不進入凋亡程序，從而抑制癌細胞的凋亡，促進膽囊癌的發(fā)展[6- 7]。近些年來，研究者從Bcl- 2和Mcl- 1入手，合成了多種抗凋亡蛋白的小分子抑制劑，其單獨或聯(lián)合化療藥物使用時均具有較好的療效[8]。2014年，Abulwerdi等[9]運用結構生物學以及高通量篩選鑒定出Mcl- 1的一種小分子抑制劑UMI- 77，其能和Mcl- 1選擇性地結合，從而拮抗Mcl- 1的抗凋亡功能，發(fā)揮誘導細胞凋亡及抑制細胞生長的作用。本研究將UMI- 77應用于膽囊癌GBC- SD細胞，了解其誘導膽囊癌細胞發(fā)生凋亡的機制，旨在為其臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人膽囊癌細胞系GBC- SD由中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫提供；Mcl- 1抑制劑UMI- 77購自美國Selleck公司；AnnexinV/PI雙染試劑盒購自中國北京晶美生物公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)均購自美國Invitrogen公司；細胞株增殖檢測試劑盒購自美國Sigma公司；兔抗人多克隆抗體Mcl- 1(ab28147)、兔抗人多克隆抗體Bcl- 2(ab59348)、兔抗人多克隆抗體Bcl- xL(ab2568)、兔抗人多克隆抗體Bax(ab53154)、兔抗人多克隆抗體Bak(ab69404)、兔抗人多克隆抗體半胱氨酸蛋白酶9剪切(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase, cleaved- caspase 9)(ab2324)、兔抗人多克隆抗體半胱氨酸蛋白酶3剪切(cleaved- caspase 3)(ab2302)和兔抗人單克隆抗體caspase切割底物(cleaved poly ADP- ribose polymerase, cleaved- PARP)(ab32064)、山羊抗兔二抗(ab6721)均購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人膽囊癌GBC- SD細胞用含10%胎牛血清(fatal bovine serun, FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基在含5%二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱內37 ℃采用常規(guī)方法進行培養(yǎng)，取對數生長期的細胞進行分組實驗。

1.3 噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖

將處于對數生長期的細胞接種于96孔板中(1×106個·孔-1)，每孔100 μl，按梯度加入濃度分別為0、5、10、15、20及30 μmol·L-1的UMI- 77，每組設5個復孔。將各組細胞分別培養(yǎng)12、24及48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3～6 h后小心吸去上清，每孔加入100 μl甲瓚溶解液孵育，在酶標儀上測定各孔OD值，同一時間點的OD值取其5個復孔的平均值。細胞存活率(%)=(不同濃度組OD值/0 μmol·L-1組OD值)×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

將處于對數生長期的細胞接種于24孔板中(1×105個·孔-1)，待次日細胞融合達到80%以上后，分別用0、5、10、15、20及30 μmol·L-1的UMI- 77處理，每組設3個復孔，將各組細胞分別培養(yǎng)24 h后，收集各孔細胞加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸并離心，加入300 μl 1×Binding Buffer進行細胞重懸，分別加入5 μl Annexin V- FITC和5 μl碘化丙啶(PI)標記，充分混勻后避光孵育20 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5 Western blotting檢測凋亡相關蛋白的表達

Western blotting檢測最適作用濃度和最適作用時間下GBC- SD細胞各組Mcl- 1、Bcl- 2、Bcl- xL、Bax、Bak、cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的表達。收集各組細胞，經PBS洗滌后加入裂解液進行細胞裂解后離心收集上清，二辛可寧酸(BCA)法測定蛋白濃度，每孔加入20 μl蛋白樣品，12%的十二烷基磺酸鈉- 聚丙烯酰胺(SDS- PAGE)凝膠電泳后，轉印至硝酸纖維素膜(PVDF)上，采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(以1∶1 000稀釋)后4 ℃孵育過夜，經TBST洗滌3次后，加入特異性二抗(以1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h后洗膜，顯影拍照。每組實驗重復3次，使用Image J軟件對條帶進行灰度定量后取其平均值。

1.6 統(tǒng)計學處理

實驗數據均以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行數據處理，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 UMI- 77抑制GBC- SD細胞增殖

MTT檢測結果如圖1所示，不同濃度的UMI- 77分別作用于GBC- SD細胞不同時間后，其細胞存活率均顯著降低，且呈劑量依賴性和時間依賴性。與同期不添加UMI- 77的細胞相比，10 μmol·L-1及以上濃度的UMI- 77處理細胞12、24及48 h后，其細胞存活率均顯著降低(P<0.05)，即均能顯著抑制細胞增殖。后續(xù)研究選擇UMI- 77的濃度為10 μmol·L-1，處理時間為24 h。

與0 μmol·L-1處理組相比，aP<0.05

圖1不同濃度UMI-77對GBC-SD細胞增殖的抑制作用

Fig1InhibitoryeffectofdifferentconcentrationsofUMI-77ontheproliferationofGBC-SDcells

2.2 UMI- 77促進GBC- SD細胞凋亡

分別用0、5、10、15、20及30 μmol·L-1的UMI- 77處理GBC- SD細胞24 h后，流式細胞術檢測細胞凋亡的結果如圖2所示，隨著藥物作用濃度的升高，細胞凋亡率逐漸增加，且呈劑量依賴性。與同期不添加UMI- 77的細胞相比，不同濃度的UMI- 77處理細胞24 h后，其凋亡率均顯著增加(P<0.05)，即不同濃度的UMI- 77均能顯著促進細胞發(fā)生凋亡(圖3)。

2.3 UMI- 77對GBC- SD細胞Mcl- 1、Bcl- 2、Bcl- xL、Bax和Bak蛋白表達的影響

Western blotting法檢測10 μmol·L-1UMI- 77處理GBC- SD細胞前后抗凋亡蛋白Bcl- 2、Bcl- xL和Mcl- 1，促凋亡蛋白Bax和Bak的表達情況如圖4所示。與未經處理細胞組比較，10 μmol·L-1UMI- 77處理GBC- SD細胞24 h后，其抗凋亡蛋白Mcl- 1的表達量顯著降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax和Bak的表達量顯著升高(P<0.05)，但Bcl- 2和Bcl- xL的蛋白表達量無顯著性變化。

2.4 UMI- 77對GBC- SD細胞cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白表達的影響

Western blotting法檢測10 μmol·L-1UMI- 77處理GBC- SD細胞前后cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的表達情況如圖5所示。與未經處理的細胞組比較，10 μmol·L-1UMI- 77處理GBC- SD細胞24 h后，活性片段cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的表達量均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A. 0 μmol·L-1組；B. 5 μmol·L-1組；C. 10 μmol·L-1組；D. 15 μmol·L-1組；E. 20 μmol·L-1組；F. 30 μmol·L-1組

圖2不同濃度UMI-77處理GBC-SD細胞24h的凋亡率

Fig2ApoptosisrateofGBC-SDcellstreatedwithdifferentconcentrationsofUMI-77for24h

與0 μmol·L-1組相比，aP<0.05

圖3不同濃度UMI-77處理GBC-SD細胞24h的凋亡率

Fig3ApoptosisrateofGBC-SDcellstreatedwithdifferentconcentrationsofUMI-77for24h

3 討 論

膽囊癌作為一種最常見的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤，約占膽道系統(tǒng)腫瘤的2/3，但由于其確切的病因尚未完全闡明，缺少特異性的臨床相關指標，病情也較隱匿，因此，確診為膽囊癌的患者的病情多數已發(fā)展到中晚期，且大部分都已發(fā)生局部浸潤或組織轉移[1]。而膽囊癌較易發(fā)生耐藥反應，且對于放化療均不敏感，加上其預后極差[10]，因此，探索膽囊癌相關治療靶點的研究尤其重要。Mcl- 1屬于Bcl- 2家族中的抗凋亡分子，其功能強大，作用獨特，且半衰期較短，在多種腫瘤組織和細胞中呈現(xiàn)高表達[11- 12]。且當Mcl- 1在腫瘤組織中過表達時，可顯著降低Bcl- 2抑制劑的抗腫瘤作用[13]。研究者從Mcl- 1入手，合成了多種抗凋亡蛋白的小分子抑制劑，其單獨或聯(lián)合化療藥物使用時均具有較好的療效[8]。這些研究表明Mcl- 1可能是腫瘤治療中的一個新靶點。

腫瘤產生和發(fā)展的重要標志之一為細胞凋亡過程發(fā)生紊亂，也是腫瘤對放化療不敏感的因素之一，因此，使用藥物促進腫瘤細胞凋亡的發(fā)生是腫瘤治療的機制之一[3- 4]。近年來，關于抗凋亡蛋白抑制劑的研究逐漸增多，其中研究得較多的是關于Bcl- 2蛋白的小分子抑制劑ABT- 737及其口服衍生物ABT- 263，其對大多數抗凋亡蛋白的活性具有抑制作用，但與Mcl- 1的結合較差，出現(xiàn)Mcl- 1高表達的腫瘤細胞往往對ABT- 737產生抗藥性，因此，研究Mcl- 1蛋白抑制劑可能對腫瘤的治療具有重要意義[14- 15]。UMI- 77是Mcl- 1的一種小分子抑制劑，其能和Mcl- 1選擇性地結合，從而拮抗Mcl- 1的抗凋亡功能，發(fā)揮促凋亡作用[9]。朱雪萍等[16]的研究表明UMI- 77誘導胃癌細胞MGC- 803發(fā)生凋亡的機制可能是通過激活內源性凋亡途徑，且其凋亡的發(fā)生呈現(xiàn)出劑量依賴性。本研究采用不同濃度的UMI- 77處理膽囊癌GBC- SD細胞，結果表明UMI- 77能顯著抑制GBC- SD細胞增殖，促進GBC- SD細胞凋亡，且呈劑量依賴性和時間依賴性。UMI- 77處理膽囊癌GBC- SD細胞24 h后，Bcl- 2家族的抗凋亡蛋白Bcl- 2和Bcl- xL的表達并無顯著性改變，而Mcl- 1的表達顯著下調，促凋亡蛋白Bax和Bak的表達顯著上調，進一步證實UMI- 77選擇性結合Mcl- 1，下調Mcl- 1在細胞中的表達，阻止了Mcl- 1/Bax及Mcl- 1/Bak的異二聚化，使Bax和Bak蛋白在細胞中的表達增高，促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡。本研究采用10 μmol·L-1UMI- 77處理GBC- SD細胞24 h后，活性的cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的表達量較未處理的細胞均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。細胞內源性凋亡途徑又稱線粒體途徑，它始于線粒體，通過釋放細胞凋亡因子募集并激活caspase 9，繼而激活下游的caspase 2、caspase 3以及caspase 6等因子啟動caspase級聯(lián)反應，最終導致細胞發(fā)生凋亡[17]。腫瘤細胞的凋亡被抑制時，其caspase 3、caspase 9和PARP處于非活化的狀態(tài)，當UMI- 77處理細胞后，會產生一系列的應激反應，通過caspase級聯(lián)反應誘導caspase(如cleaved- caspase 3、cleaved- caspase 9)和PARP切割并活化，最終通過內源性凋亡途徑誘導細胞發(fā)生凋亡。

1表示0 μmol·L-1組；2表示10 μmol·L-1組；與0 μmol·L-1組相比，aP<0.05

A. Western blotting檢測Mcl- 1、Bcl- 2、Bcl- xL、Bax和Bak蛋白；B.Mcl- 1、Bcl- 2、Bcl- xL、Bax和Bak蛋白的相對表達量

圖4UMI-77對GBC-SD細胞Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bak蛋白表達的影響

Fig4EffectsofUMI-77ontheexpressionofMcl-1,Bcl-2,Bcl-xL,BaxandBakproteinsinGBC-SDcells

1表示0 μmol·L-1組；2表示10 μmol·L-1組；與0 μmol·L-1組相比，aP<0.05

A. Western blotting檢測cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白；B. cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的相對表達量

圖5UMI-77對GBC-SD細胞cleaved-caspase9、cleaved-caspase3和cleaved-PARP蛋白表達的影響

Fig5EffectsofUMI-77ontheexpressionofcleaved-caspase9,cleaved-caspase3andcleaved-PARPproteinsinGBC-SDcells

綜上所述，本研究顯示Mcl- 1的小分子抑制劑UMI- 77可抑制膽囊癌GBC- SD細胞增殖，且呈劑量依賴性和時間依賴性，同時UMI- 77可通過caspase介導的內源性凋亡途徑誘導GBC- SD細胞發(fā)生凋亡，且呈劑量依賴性，其凋亡誘導可能是通過下調Mcl- 1的表達實現(xiàn)的，表明Mcl- 1可能成為膽囊癌研究中一個新的治療靶點，因此，對Mcl- 1的小分子抑制劑UMI- 77發(fā)揮抗腫瘤作用的具體機制進行更加深入的研究將會為抗腫瘤治療提供新選擇。