宋慧慧,李原,馬鈺,凌孫凱歌，葛崢,黃培林

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 血液內(nèi)科，江蘇 南京 210009)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一種起源于生發(fā)中心后B細(xì)胞并能夠產(chǎn)生單克隆免疫球蛋白的惡性增殖性疾病，是發(fā)病率位居第2位的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，目前仍不可治愈[1]。近年來(lái)，隨著細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，微小RNA(microRNA, miRNA)調(diào)控MM細(xì)胞惡性克隆性特征的研究也取得了許多顯著性的結(jié)果[2]。miRNA是一類(lèi)包含19～22個(gè)核苷酸的非編碼的小分子RNA，通過(guò)抑制靶基因的mRNA翻譯或直接降解mRNA來(lái)完成基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，超過(guò)50%的蛋白質(zhì)編碼基因會(huì)受到miRNA的調(diào)控[3]。miRNA在調(diào)控腫瘤發(fā)病的過(guò)程中，既可以發(fā)揮致癌基因的作用，也可以對(duì)腫瘤產(chǎn)生抑癌作用，那些具備致癌功能的miRNA被稱(chēng)為癌基因miRNA。有研究[3- 5]表明，miR- 21在胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌等實(shí)體腫瘤中起到了致癌基因的作用。對(duì)血液腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，miR- 21表達(dá)上調(diào)與B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病相關(guān)[6]，同時(shí)miR- 21的高表達(dá)對(duì)MM的發(fā)生及耐藥性也起到了至關(guān)重要的作用，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究以MM細(xì)胞株為研究對(duì)象，探討靶向抑制miR- 21表達(dá)對(duì)MM細(xì)胞生物活性的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人源性骨髓瘤細(xì)胞株U266、MM.1S、RPMI8226、NCI- H929、IM- 9(購(gòu)自American Type Culture Collection)，接種于含10%胎牛血清及青霉素(100 UI·ml-1)、鏈霉素(100 UI·ml-1)的RPMI- 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)、傳代。

1.2 qRT- PCR檢測(cè)

分別收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞株U266、MM.1S、RPMI8226、NCI- H929、IM- 9，用Fermentas試劑盒提取總的RNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA作為模板，通過(guò)qRT- PCR對(duì)miR- 21進(jìn)行檢測(cè)，miR- 21引物由科佰生物有限公司設(shè)計(jì)并合成，根據(jù)說(shuō)明配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3 基因轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U266細(xì)胞，按6×105個(gè)·ml-1接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入20 μl Lipofectamine2000試劑、20 μl miR- 21抑制物和20 μl miR- 21抑制物陰性對(duì)照物，混勻靜置放置25 min，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物及miR- 21抑制物陰性對(duì)照物48 h后收獲細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)使用抑制物終濃度為200 nmol·L-1。

1.4 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性

取1×106個(gè)·ml-1U266細(xì)胞株，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物及miR- 21抑制物陰性對(duì)照物，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h 后，每孔加入CCK- 8溶液10 μl，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下避光作用6 h，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度(A)值(每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-A抑制物處理組/A空白對(duì)照組)×100%

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將U266細(xì)胞株種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分組：(1) 實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物的U266細(xì)胞株；(2) 陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物陰性對(duì)照的U266細(xì)胞株；(3) 空 白對(duì)照組：U266細(xì)胞株。48 h后收集實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞，將3組細(xì)胞分別移入2 ml EP管中，離心后用冰凍PBS洗滌2次，加入細(xì)胞染液，室溫避光孵育10～15 min，混勻進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.6 Western blotting檢測(cè)

收集U266細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物U266細(xì)胞株以及轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物陰性對(duì)照物的U266細(xì)胞株，提取總蛋白。以100 g·L-1SDS- PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，室溫下?lián)u床封閉1 h，加入封閉牛奶稀釋的PTEN(1∶1 000)、FOXO1(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST充分洗膜后分別加入用TBST稀釋(1∶3 000)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫下?lián)u床孵育1 h，TBST洗膜后化學(xué)發(fā)光法顯色，X線底片曝光，顯影、定影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞株miR- 21表達(dá)情況

qRT- PCR檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞株U266、MM.1S、RPMI8226、NCI- H929、IM- 9，以U6作為內(nèi)參對(duì)照。NCI- H929細(xì)胞株miR- 21表達(dá)水平最低，U266、RPMI8226、MM.1S、IM- 9細(xì)胞株miR- 21相對(duì)表達(dá)量分別是NCI- H929細(xì)胞株的(35.68±2.77)倍(P<0.05)、(7.08±0.65)倍(P<0.05)、(3.88±0.32)倍(P<0.05)、(19.94±1.31)倍(P<0.05)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果選取U266作為研究對(duì)象。

2.2 U266細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物的效率

用Lipofectamine2000將miR- 21抑制物及miR- 21抑制物陰性對(duì)照物分別轉(zhuǎn)入U(xiǎn)266細(xì)胞株中，48 h后收集上述細(xì)胞，qRT- PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的miR- 21表達(dá)水平變化情況。miR- 21抑制物陰性對(duì)照組miR- 21相對(duì)表達(dá)量高于抑制物實(shí)驗(yàn)組(1.015±0.14vs0.286±0.031,P<0.05)，轉(zhuǎn)染抑制率為71.8%。

2.3 miR- 21對(duì)U266細(xì)胞增殖的影響

U266細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物及miR- 21抑制物陰性對(duì)照物，CCK- 8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率為(53.04±0.02)%，與轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率(20.89±0.17)%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 miR- 21對(duì)U266細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物的U266實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株凋亡率[(28.53±3.23)%]明顯高于轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物陰性對(duì)照組[(5.12±0.63)%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；然而，轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組U266細(xì)胞凋亡率[(0.92±0.17)%]差異無(wú)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)，提示抑制了miR- 21表達(dá)的U266細(xì)胞株細(xì)胞凋亡顯著增加。

A.空白對(duì)照組；B.轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物陰性對(duì)照組；C.轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物組

圖1流式細(xì)胞術(shù)分析miR-21對(duì)U266細(xì)胞凋亡的影響

2.5 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物的U266細(xì)胞PTEN、FOXO1蛋白表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示miR- 21調(diào)控了PTEN和FOXO1蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致了MM細(xì)胞生物學(xué)行為的異常。

1.空白對(duì)照組；2.轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物陰性對(duì)照組；3.轉(zhuǎn)染miR- 21抑制物組

圖2Westernblotting分析miR-21對(duì)U266細(xì)胞株相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

MM是克隆的B細(xì)胞惡性疾病，以骨髓中漿細(xì)胞異常和不可控制的增殖、骨損害和免疫缺陷為特征。漿細(xì)胞的惡性增殖產(chǎn)生大量無(wú)功能的單克隆免疫球蛋白和(或)輕鏈，造成機(jī)體貧血、腎臟損傷、骨質(zhì)破壞、嚴(yán)重感染以及高黏滯綜合征、凝血功能異常。迄今為止，它確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[7- 8]。miRNA這種小分子RNA可以特異性識(shí)別靶mRNA的3′- 非翻譯區(qū)(3′UTR)并與之結(jié)合，引起靶mRNA的降解或翻譯抑制。miRNA常常通過(guò)與靶基因完全互補(bǔ)結(jié)合切割靶mRNA，也可以與靶基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而阻止翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性。部分miRNA還同時(shí)具備雙重功能，與靶基因互補(bǔ)結(jié)合時(shí)直接靶向切割mRNA，與靶基因不完全結(jié)合時(shí)起調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。miR- 21是由17q23.2染色體FRA17B脆性區(qū)域編碼而成，它發(fā)揮著癌基因的作用，通過(guò)調(diào)控靶基因的mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而控制細(xì)胞的增殖、分化、侵襲等功能。其抑癌作用已經(jīng)在多種實(shí)體腫瘤和部分血液系統(tǒng)腫瘤中得到證實(shí)[3- 6]。有研究[9- 12]結(jié)果顯示，miR- 21可以利用磷酸化、乙?；?、泛素化等作用介導(dǎo)PTEN的表達(dá)，而PTEN基因作為一種抑癌基因，具有磷酸酯酶活性及蛋白絡(luò)氨酸激酶活性，是公認(rèn)的miR- 21靶基因，接受miR- 21的負(fù)性調(diào)控。PTEN基因在受到miR- 21調(diào)控的同時(shí)也影響著FOXO1的水平，它可以減少FOXO1的磷酸化，磷酸化后的FOXO1會(huì)被轉(zhuǎn)移出細(xì)胞核直接降解。FOXO1作為轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞周期及凋亡方面均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。有研究[13]表明它可以減少腫瘤細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)其增殖，所以FOXO1蛋白的缺失被認(rèn)為是導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞不可控性增殖的重要原因。近年來(lái)，F(xiàn)OXO1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的異常與miRNA之間的內(nèi)在相關(guān)性已經(jīng)成為惡性腫瘤的研究熱點(diǎn)。

本研究中，我們選取了5株骨髓瘤細(xì)胞株中miR- 21表達(dá)最高的U266細(xì)胞作為研究對(duì)象。靶向抑制U266細(xì)胞miR- 21的表達(dá)水平，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率明顯提高，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果也顯示出實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡比值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與miR- 21在其他腫瘤中的報(bào)道基本一致，提示miR- 21在腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為過(guò)程中發(fā)揮了癌基因的作用。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株下調(diào)了miR- 21的表達(dá)水平，PTEN作為其靶基因，受到miR- 21的負(fù)性調(diào)控，所以PTEN蛋白表達(dá)增加，而高表達(dá)的PTEN弱化了FOXO1的磷酸化作用，使得FOXO1降解減少，故而其蛋白水平也相應(yīng)升高。這一結(jié)果在陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組中也得到了反向的證明。

綜上所述，miR- 21在MM細(xì)胞中發(fā)揮了癌基因的作用，減少miR- 21的表達(dá)可以抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。它可能是通過(guò)介導(dǎo)PTEN的水平進(jìn)而影響下游FOXO1的轉(zhuǎn)錄功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的調(diào)控。本研究結(jié)果為MM的發(fā)病機(jī)制和臨床診療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，值得進(jìn)一步深入研究。