左智，左鵬飛，王鑫，史秋寅，丁建東，左揚(yáng)松，馬根山

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 心血管內(nèi)科，江蘇 南京 210009；2.漣水縣人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，江蘇 漣水 223400)

雞胚模型已被廣泛應(yīng)用于多種研究領(lǐng)域[1- 12]，但其影像學(xué)研究卻困難重重[13- 19]。究其原因主要在于雞胚的“胎動”。在雞蛋中雞胚漂浮在尿囊液中，無法對其進(jìn)行物理固定；多種麻醉藥物也被證實(shí)效果甚微，甚至可能產(chǎn)生毒副作用、降低存活率[13]。磁共振掃描通常需要一定的時間，在雞胚移動的情況下會出現(xiàn)運(yùn)動偽影，圖像質(zhì)量大打折扣。有些研究者將雞胚處死后再進(jìn)行掃描[11,17,20- 24]，雖然消除了偽影，但重復(fù)觀察失去可能，研究深度和意義都受到極大的限制。

低溫冷卻對雞胚具有鎮(zhèn)靜效果，Bain等[16]在4 ℃冰箱內(nèi)冷卻雞胚1 h，可以實(shí)現(xiàn)一定程度的鎮(zhèn)靜。但隨著雞胚發(fā)育，其對1 h的冷卻耐受逐漸增強(qiáng)，孵育10 d后需要更長時間來保證鎮(zhèn)靜效果[25]。我們設(shè)計(jì)了在4 ℃ 環(huán)境下依據(jù)雞胚孵育日齡制定個體化的冷卻時間，保證足夠長時間的鎮(zhèn)靜效果。本研究在使用改良鎮(zhèn)靜技術(shù)后，對雞胚荷瘤模型進(jìn)行充分的影像學(xué)觀察，大大擴(kuò)展了該模型在腫瘤研究領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料

受精的雞蛋購于本地農(nóng)場，經(jīng)清潔后置于孵化箱中，孵化環(huán)境設(shè)置為溫度37.8 ℃、濕度60%。孵化4 d后 在雞蛋氣室端開窗，注意不要損傷尿囊膜。開窗后檢查雞胚是否發(fā)育正常，移除未受精的、死亡的雞蛋。選取尿囊膜血管網(wǎng)豐富的雞蛋，在尿囊膜正中間移植腫瘤細(xì)胞，移植后用醫(yī)用膠布封閉雞蛋的開口，妥善放置回孵化箱中。

1.2 方法

1.2.1 改良冷卻鎮(zhèn)靜技術(shù) 用29只雞胚改良冷卻鎮(zhèn)靜技術(shù)，隨機(jī)分為3組：A組(n=10)作為對照持續(xù)孵化，不予人為干預(yù)；B組(n=10)每天在4 ℃冰箱冷卻1 h；C組(n=9)用于確定每日齡雞胚最佳的冷卻時間。C組再隨機(jī)分為C1、C2、C3 3個亞組，每個亞組3個雞胚。隨著雞胚孵化日齡的增加，對冷卻時長的需求也增加。C1組使用與前一日相同的冷卻時長，C2組多冷卻10 min，而C3組在此基礎(chǔ)上再多冷卻10 min，冷卻后立即使用磁共振掃描確定是否達(dá)到鎮(zhèn)靜。取3個亞組磁共振成像(MRI)沒有偽影的最短冷卻時長作為該日齡的最佳時長。

1.2.2 移植腫瘤細(xì)胞 本研究使用人乳腺癌細(xì)胞MDA- MB- 231細(xì)胞系，在含10%FBS的L- 15培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在雞胚孵化第7天，在尿囊膜上放置直徑為6 mm 的橡膠圈，2×106個腫瘤細(xì)胞混合在20 μl濃度為50%的Matrigel基質(zhì)膠中，種植于橡膠圈范圍內(nèi)(圖1)。

腫瘤細(xì)胞移植96 h后形成了肉眼可見的實(shí)體腫瘤黑箭頭：實(shí)體移植瘤；白箭頭：用來限制腫瘤生長范圍的橡膠圈

圖1雞胚荷瘤模型實(shí)物圖像

1.2.3 磁共振掃描 使用Bruker高場11.7T動物磁共振系統(tǒng)、60 mm正交線圈完成掃描。從腫瘤細(xì)胞移植后的第4天到第9天，每天使用快速自旋回波(rapid aquicision with relaxation enhancement, RARE)序列掃描獲得T2加權(quán)圖像，具體參數(shù)如下：重復(fù)時間(TR)/回波時間(TE)4 320/45 ms, 矩陣數(shù)目650×650,分辨率77 μm×91 μm,層厚0.5 mm,層間距為零,RARE值8,激勵次數(shù)4。

1.2.4 定量分析腫瘤體積、評估腫瘤重量、病理組織學(xué)分析 在每一個MRI圖像層面上使用Segment軟件描記腫瘤輪廓，計(jì)算切面面積，所有層面面積總和乘以層厚估算出腫瘤體積。作時間-體積點(diǎn)線圖評估腫瘤的增殖趨勢。在最后1天所有掃描完成后處死雞胚，切下實(shí)體腫瘤，稱重并用福爾馬林保存。將腫瘤標(biāo)本冷凍切片并染色，與所獲得的MRI圖像對比，評價充分鎮(zhèn)靜后的MRI的質(zhì)量與可靠程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Speramanrho測試、Mahn- Whitney U測試用于評估磁共振估算的腫瘤體積和腫瘤重量的關(guān)聯(lián)程度，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 改良鎮(zhèn)靜技術(shù)

通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，對于孵化日齡大于10 d的雞胚，1 h的常規(guī)冷卻已經(jīng)達(dá)不到預(yù)期的鎮(zhèn)靜效果，運(yùn)動偽影嚴(yán)重影響了MRI。經(jīng)過C組每一天的比較，我們總結(jié)出1份改良鎮(zhèn)靜時間表，詳見表1。使用改良鎮(zhèn)靜技術(shù)可以保證孵化6～18 d的雞胚充分鎮(zhèn)靜，而且并不會提高雞胚的死亡率，非常安全。

表1改良冷卻鎮(zhèn)靜技術(shù)

孵化日齡冷卻時長(達(dá)到鎮(zhèn)靜的最短時間)/minA組(n=10)B組(n=10)C組(n=9)6060607060608060609060601006070110607012060701306090140609015060110160601101706012018060120存活率0.8(8/10)0.9(9/10)0.89(8/9)

2.2 高分辨率MRI

改良后延長的鎮(zhèn)靜時間允許我們使用分辨率更高、耗時更長的磁共振序列，獲得的圖像像素可以精確到77 μm×91 μm。圖像精度、清晰度大大提高，可以觀察非常小的解剖結(jié)構(gòu)。我們可以清楚地看到每一天雞胚大腦、心臟、眼、肝臟、肌胃、膝關(guān)節(jié)、肺、小腸、喙以及脊椎的生長(圖2)，這在以往是非常不可思議的。

1.腦；2.心臟；3.眼；4.肝臟；5.胃(俗稱雞胗)；6.膝關(guān)節(jié)；7.肺；8.小腸；9.雞喙；10.脊椎

圖2雞胚生長過程的磁共振圖像

2.3 腫瘤增殖的MRI分析

15只荷瘤雞胚用于觀察腫瘤增殖，其中2只雞胚死亡，4只腫瘤細(xì)胞沒有成功移植，剩下的9只完成了每日1次的磁共振掃描。MRI下清晰地觀察到腫瘤每日的增殖過程(圖3)。每一天每只荷瘤雞胚都獲得了相當(dāng)高質(zhì)量的MRI圖像。通過分析我們發(fā)現(xiàn)，雖然9只雞蛋都被移植了2×106個腫瘤細(xì)胞，但腫瘤的增殖速度、最終長成的實(shí)體瘤的體積大小卻不盡相同(圖4)。在腫瘤細(xì)胞移植后的第9天，腫瘤的體積懸殊，4～37.5 mm3。去除了結(jié)締組織、血管后，最終實(shí)體瘤的體積為0.77～18.77 mm3。尿囊膜移植瘤的具體結(jié)構(gòu)見圖5，包括實(shí)體瘤部分、血管以及一些疏松結(jié)締組織。研究中并沒有觀察到腫瘤的生長對于雞胚發(fā)育的異常影響。

在腫瘤被移除后對其稱重，9個腫瘤的重量見表2。對于磁共振測量的體積以及實(shí)際腫瘤的稱重進(jìn)行回歸分析，二者存在顯著的線性關(guān)系，R2=0.9，P<0.01。平均重量/體積的值等于0.78 mg·mm-3，與已知數(shù)據(jù)1 mg·mm-3相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.65)。

2.4 病理結(jié)果

腫瘤的病理結(jié)果見圖6，可以發(fā)現(xiàn)移植瘤的結(jié)構(gòu)分為數(shù)個部分，和尿囊膜直接接觸的部分細(xì)胞密度最高，而離尿囊膜稍遠(yuǎn)的腫瘤中心部分細(xì)胞密度較低，血管新生程度也較低。

3 討 論

觀察腫瘤增殖對于研發(fā)抗腫瘤藥物非常重要。目前裸鼠是荷瘤動物的金標(biāo)準(zhǔn)，但其成本高，且動物倫理的審核越來越嚴(yán)格。在實(shí)驗(yàn)動物福利和保護(hù)的大前提下，裸鼠研究將需要越來越大的經(jīng)濟(jì)和時間成本。雞胚作為活體模型早已得到廣泛使用，由于尚未發(fā)育完善的免疫系統(tǒng)、血供豐富可直視的尿囊膜結(jié)構(gòu)，具有作為荷瘤載體的重大價值和潛力[4]。使用雞胚荷瘤模型進(jìn)行短期預(yù)實(shí)驗(yàn)，可以降低實(shí)驗(yàn)成本，減少裸鼠使用數(shù)量，提高實(shí)驗(yàn)效率。

在腫瘤研究中影像學(xué)數(shù)據(jù)必不可少，無創(chuàng)的磁共振掃描能在不干預(yù)實(shí)驗(yàn)樣本的情況下提供相當(dāng)多的信息。截至目前，活體雞胚M(jìn)RI的最小像素為200 μm×200 μm[13- 16,18,24- 26]。雞胚的不穩(wěn)定限制了單次掃描的時長，但是圖像分辨率越高，花費(fèi)的掃描時間越長。而移植瘤由于只有數(shù)天的增殖時間，體積不會太大，內(nèi)在結(jié)構(gòu)更加微小，且往往形狀不規(guī)則。因此若想使用磁共振來分析這些腫瘤，高分辨率的必要性不言而喻。本研究改良了Bain團(tuán)隊(duì)的冷卻鎮(zhèn)靜技術(shù)[16,26]，按照日齡的增加確定了每天最優(yōu)的冷卻時間，在保證安全的前提下提高了鎮(zhèn)靜效率，將成像像素進(jìn)一步縮小到77 μm×91 μm。

粉色圓圈內(nèi)為逐漸長大的實(shí)體瘤

圖3移植瘤成像及腫瘤增殖觀察

與免疫組化結(jié)果的對比證明了改良后磁共振評估的可靠性與精確程度。由于遠(yuǎn)離血供，腫瘤核心部分細(xì)胞密度較低、新生血管欠活躍，磁共振圖像中觀察到明顯減低的信號密度；實(shí)體腫瘤的外周部分在磁共振圖像中呈現(xiàn)較高的信號，這與組織學(xué)證明的豐富的血管系統(tǒng)、密集的腫瘤細(xì)胞與活躍的增殖遷移結(jié)果一致。本研究成功地使用了磁共振觀察雞胚荷瘤的發(fā)展過程，這都得益于改良鎮(zhèn)靜技術(shù)，使雞胚荷瘤模型的應(yīng)用價值大大提高。

圖中虛線為每一個樣本的增長趨勢，實(shí)線為每日平均值

圖4移植后4～9d尿囊膜腫瘤的體積和增殖率

空心箭頭：實(shí)體腫瘤主體；白色箭頭：結(jié)締組織，由疏松腫瘤細(xì)胞等組成；灰色箭頭：血管

圖5移植后第9天實(shí)體腫瘤磁共振掃描的所有切面

表29只實(shí)體瘤移植第9天磁共振估算體積與實(shí)測重量的對比

樣本號腫瘤體積/mm3腫瘤重量/mg118.7713.727.763.736.703.345.994.751.952.2611.198.678.765.280.772.691.782.0

圖a為磁共振高分辨率成像結(jié)果，b～d為同一個腫瘤的不同染色結(jié)果。與圖a結(jié)構(gòu)Ⅱ?qū)?yīng)的部分，在圖b伊紅染色、圖c Ki- 67染色、圖d肌間線蛋白染色均為深染，體現(xiàn)該部分更密集的細(xì)胞密度、更活躍的細(xì)胞遷移和更豐富的血管新生。而磁共振圖像中該部分表現(xiàn)出更高的灰度值，這與病理結(jié)果一致

圖6高分辨率磁共振腫瘤成像與病理結(jié)果對比