徐可心，吳丹丹，吳圣潔，王雪融

(南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)系，江蘇 南京 210029)

胃癌是世界第5大常見(jiàn)惡性腫瘤，在癌癥相關(guān)死亡中占第3位[1]。因此，了解胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找胃癌轉(zhuǎn)移中起重要作用的分子尤為重要。星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因- 1(astrocyte elevated gene- 1，AEG- 1)[2]也被稱(chēng)為metadherin(MTDH)或者lysine- rich CEACAM- 1 associated protein(LYRIC)，研究證實(shí)它參與了乳腺癌的肺部轉(zhuǎn)移[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，AEG- 1的表達(dá)與多種腫瘤例如乳腺癌[4]、肺癌[5]、結(jié)腸癌[6]、肝癌[7]、胃癌[8]等的臨床分型、分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。既往研究表明，AEG- 1可通過(guò)激活PI3K/Akt、MAPK/ERK、NF- κB和Wnt/β- catenin等信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活、代謝、上皮- 間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化(epithelial- mesenchymal transition，EMT)、遷移、侵襲、保護(hù)性自噬和血管形成等[9]。然而，AEG- 1在胃癌遷移中的作用機(jī)制尚未明確。

EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的起始和關(guān)鍵步驟，腫瘤細(xì)胞遷移的一個(gè)重要標(biāo)志就是腫瘤細(xì)胞發(fā)生了EMT。真核翻譯起始因子4E(eIF4E)是翻譯起始復(fù)合物的一個(gè)重要組成成分[10]，既往研究表明eIF4E在細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、侵襲、EMT和血管生成中起重要作用，在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)eIF4E促進(jìn)腫瘤形成、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[11]。提示eIF4E可作為腫瘤診斷的分子標(biāo)志物及治療的新靶點(diǎn)[12]。本研究的目的是明確AEG- 1通過(guò)上調(diào)eIF4E表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移，為eIF4E作為腫瘤診斷的分子標(biāo)志物及治療的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

Lipofectamine 2000?transfection reagent(11668- 019)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司(Carlsbad, CA, USA)；AEG- 1/MTDH抗體(13860- 1- AP)購(gòu)自中山金橋生物技術(shù)有限公司(中國(guó)北京)；eIF4E抗體(9742)購(gòu)自Cell Signaling Technology.Inc(Beverly，MA，USA)；AEG- 1質(zhì)粒是在pcDNA的空載體中插入編碼AEG- 1的全長(zhǎng)DNA序列(由寧夏醫(yī)科大學(xué)劉坤梅教授饋贈(zèng))；eIF4E質(zhì)粒是在p3×flag- CMV- 14的空載體中插入編碼eIF4E的全長(zhǎng)DNA序列(由美國(guó)Emory University的Shi- Yong Sun教授贈(zèng)送)。AEG- 1、eIF4E siRNA購(gòu)自上海吉瑪公司。AEG- 1 siRNA(共兩個(gè)序列)5′- CAGAAGAAGAAGAACCGGAdTdT- 3′，5′- GCAGCAAGGCAGUCUUUAAGUTT- 3′；eIF4E siRNA(共兩個(gè)序列)5′- GGACGAUGGCUAAUUACAU- 3′，5′- AAGCAAACCUGCGGCUGAUCUTT- 3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞株(SGC7901中分化腺癌)來(lái)源于上海生命科學(xué)研究院，細(xì)胞在含5%胎牛血清(FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)的RPMI 1640(Hyclone, Logan, UT, USA)培養(yǎng)基中于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

按transwell小室說(shuō)明書(shū)操作，細(xì)胞消化重懸于無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，吸取400 μl按5×104個(gè)·L-1密度接種在transwell小室的上室，吸取600 μl含0.5%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基或100 ng·ml-1CXCL12的0.5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)24 h后 取出小室，PBS清洗3次，用棉簽小心擦去小室上側(cè)的細(xì)胞，待干燥后用甲醇固定30 min，晾干后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下拍攝穿過(guò)濾膜進(jìn)入膜下側(cè)的細(xì)胞(發(fā)生遷移的細(xì)胞)。

1.4 質(zhì)粒、siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以5×105個(gè)·孔-1的密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)用1 μg質(zhì)粒、100 nmol·L-1siRNA按 Lipofectamine?2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，4～6 h后換正常培養(yǎng)液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western blotting[13]

提取全細(xì)胞蛋白(裂解液即1%Triton，成分為HEPES(pH=7.5)40 mmol·L-1，EDTA 1 mmol·L-1，NaCl 120 mmol·L-1，焦磷酸鈉10 mmol·L-1，NaF 50 mmol·L-1，原釩酸鈉0.5 mmol·L-1，甘油磷酸鈉10 mmol·L-1，1% Triton X- 100，PMSF臨用前加，終濃度為1 mmol·L-1)，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度(考馬斯亮藍(lán)G- 250液：稱(chēng)取0.1 g考馬斯亮藍(lán)G- 250，先加入50 ml 95%乙醇，再加100 ml 85%磷酸，單蒸水定容至1 000 ml后濾紙過(guò)濾，常溫避光保存)。Western blotting實(shí)驗(yàn)即用SDS- PAGE電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜[蛋白電泳、電轉(zhuǎn)裝置(9204355 Rev A)和電源購(gòu)自美國(guó)Bio- Rad公司]后依次孵育一抗、PBST洗膜、孵育二抗、洗膜、ECL顯影、熒光化學(xué)發(fā)光成像(ChemiScope 3400 Mini，購(gòu)自上海勤翔科技有限公司)，具體操作過(guò)程見(jiàn)我們既往發(fā)表的文章[12]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間的比較采用雙側(cè)Student’st檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均采用GraphPadInStat 3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 過(guò)表達(dá)AEG- 1誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，同時(shí)上調(diào)eIF4E的表達(dá)

為了探討AEG- 1在胃癌細(xì)胞遷移中的作用，我們首先檢測(cè)了過(guò)表達(dá)AEG- 1對(duì)EMT的影響。結(jié)果顯示，在HEK- 293T和SGC7901細(xì)胞上瞬時(shí)轉(zhuǎn)染編碼AEG- 1的質(zhì)粒，與對(duì)照質(zhì)粒pcDNA轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染AEG- 1組的AEG- 1蛋白表達(dá)明顯增加。而且過(guò)表達(dá)AEG- 1組的細(xì)胞上，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E- cadherin表達(dá)減少，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N- cadherin表達(dá)增加，提示發(fā)生了EMT。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，eIF4E和cyclinD1的表達(dá)都增加，提示過(guò)表達(dá)AEG- 1上調(diào)eIF4E的蛋白表達(dá)，并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT(圖1)。

2.2 沉默AEG- 1的表達(dá)抑制細(xì)胞發(fā)生EMT，同時(shí)下調(diào)eIF4E的表達(dá)

我們?cè)赟GC7901細(xì)胞上用lipofectamin轉(zhuǎn)染AEG- 1的siRNAs和對(duì)照siRNAs瞬時(shí)沉默AEG- 1的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比AEG- 1siRNAs轉(zhuǎn)染組AEG- 1的蛋白表達(dá)水平明顯降低，而且沉默AEG- 1表達(dá)組E- cadherin表達(dá)上調(diào)，N- cadherin表達(dá)下調(diào)，提示抑制了EMT。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)eIF4E和cyclinD1的表達(dá)下調(diào)，結(jié)果提示沉默AEG- 1下調(diào)eIF4E的表達(dá)并抑制胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT(圖2)。

2.3 沉默AEG- 1的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的遷移以及CXCL12誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞遷移，并同時(shí)下調(diào)eIF4E的表達(dá)

發(fā)生EMT是細(xì)胞遷移侵襲的初始步驟，接著我們用transwell的方法檢測(cè)了干擾AEG- 1的表達(dá)對(duì)SGC7901細(xì)胞株遷移能力的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，沉默AEG- 1組遷移到小室下室一側(cè)的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，提示沉默AEG- 1表達(dá)抑制了胃癌細(xì)胞的遷移能力。我們既往研究報(bào)道CXCL12促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的遷移，因此我們接著檢測(cè)了給予CLCX12刺激對(duì)細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CXC12組下室的細(xì)胞數(shù)目明顯增多，提示胃癌細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)；沉默AEG- 1再給予CLCX12刺激，與只給予CLCX12刺激組相比下室的細(xì)胞數(shù)目減少，但與只沉默AEG- 1組相比下室的細(xì)胞數(shù)目增多，提示沉默AEG- 1可減弱CXCL12誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移(圖3A)。Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AEG- 1沉默組eIF4E和cyclin D1表達(dá)減少，CXCL12處理組二者表達(dá)增加，而既沉默AEG- 1表達(dá)又給予CXCL12處理組eIF4E和cyclin D1的表達(dá)介于上述兩組之間。提示給予或不給予CXCL12刺激時(shí)，沉默AEG- 1的表達(dá)均可抑制細(xì)胞的遷移，而且同時(shí)伴有eIF4E的表達(dá)下調(diào)，cyclinD1表達(dá)下調(diào)(圖3B)。

圖1Westernblotting檢測(cè)結(jié)果圖

NC：陰性對(duì)照

圖2Westernblotting檢測(cè)結(jié)果圖

NC：陰性對(duì)照

圖3Transwell(A)及Westernblotting(B)檢測(cè)結(jié)果圖

2.4 過(guò)表達(dá)eIF4E部分逆轉(zhuǎn)沉默AEG- 1表達(dá)引起的細(xì)胞遷移的抑制作用

上述研究都檢測(cè)到了eIF4E在A(yíng)EG- 1調(diào)控胃癌細(xì)胞EMT和遷移中的伴隨變化，為了探討eIF4E在A(yíng)EG- 1誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞遷移中的作用，我們?cè)赟GC7901 AEG- 1穩(wěn)定沉默的細(xì)胞株上過(guò)表達(dá)eIF4E進(jìn)行transwell實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，單獨(dú)沉默AEG- 1抑制細(xì)胞遷移，過(guò)表達(dá)eIF4E促進(jìn)細(xì)胞遷移，而同時(shí)沉默AEG- 1和過(guò)表達(dá)eIF4E的組，穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)介于上述兩組之間。結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)eIF4E可以部分逆轉(zhuǎn)沉默AEG- 1的表達(dá)引起的細(xì)胞遷移的抑制(圖4)。

Control：scramble shRNA

圖4transwell檢測(cè)結(jié)果圖

3 討 論

本研究我們探討了AEG- 1在胃癌細(xì)胞遷移中的作用和機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默AEG- 1的表達(dá)引起上皮細(xì)胞標(biāo)志物E- cadherin的表達(dá)增高，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N- cadherin的表達(dá)降低，提示抑制胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT。反之過(guò)表達(dá)AEG- 1觀(guān)察到相反的變化，提示AEG- 1促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT。這些結(jié)果表明AEG- 1通過(guò)誘導(dǎo)EMT來(lái)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移。既往的研究發(fā)現(xiàn)AEG- 1通過(guò)Wnt/β- catenin和LPS/TLR4/p65NF- κB信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和炎癥反應(yīng)[14- 15]，但在腫瘤遷移中的機(jī)制仍未明確。

AEG- 1下游信號(hào)分子主要有PI3K/Akt、NF- κB、MAPK/ERK、c- Myc、Wnt和cyclinD1[16]，我們的研究中也觀(guān)察到沉默AEG- 1的表達(dá)下調(diào)cyclinD 1的蛋白表達(dá)，與既往的研究報(bào)道一致。激活eIF4E的活化是某些具有較長(zhǎng)5′- UTR結(jié)構(gòu)的mRNA翻譯起始的限速步驟，在多種腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AEG- 1上調(diào)eIF4E的蛋白表達(dá)，沉默AEG- 1下調(diào)eIF4E的蛋白表達(dá)，提示eIF4E在A(yíng)EG- 1誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生遷移中起重要作用，但具體的調(diào)控機(jī)制仍不明確。已有的研究報(bào)道，AEG- 1通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路激活轉(zhuǎn)錄因子FOXO1、FOXO3a、NF- κB和AP- 1[17- 19]，AEG- 1也可以直接和p65 NF- κB、SND1和PLZF相互作用來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[20- 22]，都可能通過(guò)間接的機(jī)制上調(diào)eIF4E的表達(dá)。此外，在表觀(guān)遺傳學(xué)水平、eIF4E啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白和DNA修飾如乙?；图谆部赡苷{(diào)控eIF4E的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。因此，AEG- 1調(diào)控eIF4E的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，AEG- 1通過(guò)上調(diào)eIF4E的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移，我們的研究進(jìn)一步證實(shí)了AEG- 1在胃癌細(xì)胞遷移中的重要作用以及揭示了AEG- 1通過(guò)eIF4E促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移的分子作用機(jī)制，為胃癌轉(zhuǎn)移的治療提供了新的靶點(diǎn)和治療策略。