龔瓊，歐陽(yáng)雅帆，黃艷露，黃敏

(中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院，廣東深圳 518107)

阿爾茨海默癥(AD)是一種以認(rèn)知功能障礙和學(xué)習(xí)記憶能力減退為臨床癥狀的神經(jīng)退行性疾病，腦組織淀粉樣蛋白沉積(Aβ)和Tau蛋白纖維纏結(jié)是其病理基礎(chǔ)[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是AD病因?qū)W中的一個(gè)重要過(guò)程，致病性錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的積累和細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的破壞是誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的基礎(chǔ)機(jī)制，可導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和細(xì)胞死亡[2,3]。在有害或者應(yīng)激條件下，細(xì)胞通過(guò)激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)的適應(yīng)性反應(yīng)途徑逃避?chē)?yán)重?fù)p害。葡萄糖相關(guān)蛋白78(GRP78)是通過(guò)關(guān)鍵途徑啟動(dòng)UPR的主傳感器[4]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，錯(cuò)誤折疊蛋白抑制GRP78和傳感蛋白之間的相互作用，從而啟動(dòng)UPR信號(hào)傳導(dǎo)，產(chǎn)生細(xì)胞凋亡作用[5]。小檗堿是從黃連素中提取的一種天然異喹啉類(lèi)生物堿，具有多種藥理作用[5]，如抗炎、調(diào)節(jié)血糖、抗病毒、調(diào)脂等，而且對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)中自身免疫性疾病、腦血管疾病、癲癇、焦慮抑郁、AD等疾病亦有一定改善作用[6,7]。最近研究表明，小檗堿能降低AD中Aβ沉積和改善三轉(zhuǎn)基因AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[8]。2016年7月～2018年3月，本研究觀察了小檗堿對(duì)三轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 三轉(zhuǎn)基因AD小鼠購(gòu)自美國(guó)Jax實(shí)驗(yàn)室，能穩(wěn)定表達(dá)人源突變基因APPSwe、tauP301L以及鼠源突變基因PSl[9,10]。小檗堿購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度約99%。原代細(xì)胞培養(yǎng)皿購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，DMEM/F12(1∶1)細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，MTT試劑盒、細(xì)胞裂解液、乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，二甲基亞砜(DMSO)和3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，GRP78、Caspase-3和Bcl-2、Bax以及GAPDH抗體、兔鼠通用二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 原代海馬神經(jīng)元分離和培養(yǎng) 取出生24 h內(nèi)的三轉(zhuǎn)基因AD小鼠，75%乙醇全身消毒，在顯微鏡下無(wú)菌條件取出海馬組織，剔除血管膜，用眼科剪剪碎，加入0.125%胰蛋白酶，37 ℃消化30 min，用含10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化。加入含血清的培養(yǎng)基(高糖EMEM+2 mmol/L谷氨酰胺+0．1 U/mL胰島素+10%FBS)，吹打混勻3次，每次吹打后靜置3～5 min。取上清液，200目細(xì)胞篩過(guò)濾，4 ℃、1 000 r/min離心5 min。棄掉上清，加入神經(jīng)元培養(yǎng)基，巴氏管吹打混勻細(xì)胞，將細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿、96孔板中、玻片上、6孔板中(已用0.1 mg/mL多聚賴(lài)氨酸包被)，分別加入完全培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后更換為無(wú)血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h加入阿糖胞苷(終濃度為10 μmol/L)，以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)，每3～4天換液1次，倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)元生長(zhǎng)狀況。

1.3 海馬神經(jīng)元分組及處理 在上述1.2神經(jīng)元培養(yǎng)第7天時(shí)，隨機(jī)分為1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組、對(duì)照組，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，前兩組分別加入1、10 μmol/L小檗堿兩種濃度(小檗堿溶于DMSO中)，對(duì)照組加入等體積的DMSO，干預(yù)24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用TUNEL法。將上述三組神經(jīng)元培養(yǎng)基棄掉，PBS洗滌10 min×3次，4%多聚甲醛固定樣本爬片1 h；PBS洗滌玻片5 min×3次，室溫下封閉液封閉玻片30 min；PBS洗滌玻片5 min×3次，加入含0.1%～0.2% Triton X-100的PBS，冰浴5 min。將50 μL酶溶液與400 μL的標(biāo)記液混合配制成500 μL TUNEL反應(yīng)試劑，充分混勻后在玻片上滴加50 μL TUNEL反應(yīng)試劑，37 ℃、避光、濕盒中孵育1 h。PBS洗滌玻片5 min×3次，滴加DAPI，5 min后吸出。PBS洗滌玻片5 min×3次，滴加抗淬滅劑50 μL，封片。采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用MTT法。以5×103/孔的細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板中事先用多聚賴(lài)氨酸處理，培養(yǎng)第7天時(shí)加入無(wú)血清的培養(yǎng)基洗滌3次，1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組分別加入1、10 μmol/L小檗堿，對(duì)照組加入等體積的DMSO，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，檢測(cè)小檗堿作用24 h時(shí)，各組細(xì)胞相對(duì)存活率。采用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)570 nm)檢測(cè)各孔吸光度(A)值。對(duì)照組細(xì)胞存活率標(biāo)化為100%，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。細(xì)胞相對(duì)存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A570值/對(duì)照組A570值)×100%。

1.6 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清液LDH釋放率檢測(cè) 取上述3組培養(yǎng)基上清液，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，收集上清液，其他步驟按照LDH細(xì)胞毒性試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)490 nm)檢測(cè)小檗堿干預(yù)24 h各孔A490nm值。LDH釋放率(%)=(處理樣品A490值-樣品對(duì)照孔A490值)/(細(xì)胞最大酶活性A490值-樣品對(duì)照孔A490值)×100%。

1.7 海馬神經(jīng)元細(xì)胞GRP78、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。將上述1.3中的3組細(xì)胞培養(yǎng)基棄掉，用PBS洗滌3次，加入簡(jiǎn)易型細(xì)胞裂解液(Lysis Buffer+PMSF+蛋白酶抑制劑)200 μL至6孔板，充分吹打，然后超聲破碎、離心，提取上清液，BCA法蛋白定量合格。然后進(jìn)行SDS凝膠電泳，電泳結(jié)束將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗滌10 min×3次，分別加入一抗[GRP78(1∶1 000)、Caspase-3(1∶3 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000)]，4 ℃過(guò)夜；次日PBST洗滌10 min×3次，室溫下加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)。TBST洗滌10 min×3次，采用萬(wàn)類(lèi)ECL發(fā)光液顯影，GraphPad Prism5分析作圖,數(shù)據(jù)圖片采用Quanlity One軟件掃描。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白電泳條帶灰度值/GAPDH蛋白電泳條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較 1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組、對(duì)照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率分別為(23.43±3.21)%、(16.72±4.02)%、(43.59±3.68)%，組間兩兩比較P均<0.05。

2.2 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率比較 1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組、對(duì)照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率分別為(48.25±12.09)%、(67.16±11.41)%、(39.57±13.54)%，組間兩兩比較P均<0.05。

2.3 各組海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清液LDH釋放率比較 1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組、對(duì)照組海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清液LDH釋放率分別為(12.43±3.41)%、(8.23±2.58)%、(18.79±4.23)%，組間兩兩比較P均<0.05。

2.4 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞GRP78、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞GRP78、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01；與1 μmol/L小檗堿組相比，#P<0.05。

3 討論

AD發(fā)病的因素包括Aβ沉積、Tau蛋白過(guò)度磷酸化、活性氧自由基增多等，這些因素均能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的錯(cuò)誤折疊蛋白增加，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[3]。早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞對(duì)傷害的適應(yīng)性反應(yīng)，持久或過(guò)強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。有研究表明，抑制過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能明顯減少細(xì)胞凋亡。GRP78是誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的關(guān)鍵分子蛋白，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白，可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的錯(cuò)誤折疊蛋白功能，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷。有研究表明，在氧化應(yīng)激失衡、缺血缺氧等狀態(tài)下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的UPR，從而激活轉(zhuǎn)錄因子6和啟動(dòng)GRP78基因，上調(diào)GRP78蛋白表達(dá)，進(jìn)而改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能[3,4]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組細(xì)胞凋亡率、LDH釋放率下降，細(xì)胞存活率增加，且10 μmol/L小檗堿組變化更明顯。表明小檗堿能降低神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率、抑制LDH釋放水平，對(duì)三轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬神經(jīng)元具有明確的保護(hù)作用，且具有量效關(guān)系。

目前小檗堿發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制還不清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道，小檗堿能通過(guò)增加自噬水平LC3-Ⅱ、Beclin-1表達(dá)，降低Aβ沉積和改善認(rèn)知功能，同時(shí)減少海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡[8]。此外，Liang等[11]研究表明，小檗堿能通過(guò)降低Aβ25-35誘導(dǎo)體外原代神經(jīng)元線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C水平，提高其抗氧化能力，從而降低神經(jīng)元凋亡。本研究進(jìn)一步探索小檗堿對(duì)AD神經(jīng)元的保護(hù)作用是否與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組GRP78蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，且10 μmol/L小檗堿組GRP78蛋白表達(dá)更高，表明小檗堿可呈劑量依賴(lài)性上調(diào)GRP78蛋白表達(dá)，從而改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可激活UPR，UPR分別是由GRP78蛋白和RNA激活蛋白樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激、ATF-6等組成，能啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而介導(dǎo)凋亡信號(hào)通路，激活下游信號(hào)通路，如Caspase、CHOP、Bcl-2家族等[12]。Caspase-3在執(zhí)行凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13,14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L小檗堿組、10 μmol/L小檗堿組較對(duì)照組Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)增加。由此推測(cè)，小檗堿可增加GRP78蛋白及抑制Caspase-3蛋白表達(dá)，幫助糾正及重組錯(cuò)誤折疊蛋白、細(xì)胞未折疊的正確組裝，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；同時(shí)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)及下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)AD神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。但小檗堿何種濃度對(duì)AD神經(jīng)元有最佳保護(hù)作用仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，小檗堿體外可抑制三轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少神經(jīng)元凋亡，保護(hù)三轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬神經(jīng)元。其機(jī)制可能與上調(diào)GRP78蛋白、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)及抑制Caspase-3蛋白、促凋亡蛋白Bax表達(dá)有關(guān)。干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78表達(dá)，可能對(duì)AD治療具有潛在意義。