王遠飛，李曙芳，王新鋼，王永麗，許文黎，黃立群，岳娟，安全

(中國輻射防護研究院藥物安全性評價中心，藥物毒理與放射損傷藥物山西省重點實驗室，中核放射毒理與放射性藥物臨床前評價重點實驗室，太原 030006)

最新的癌癥統(tǒng)計報告指出[1]：肺癌為我國癌癥發(fā)病率之首，乳腺癌在女性癌癥中發(fā)病率最高。隨著一系列胸部腫瘤放療的增加，射線導致的肺部損傷尤為突出[2](發(fā)生率約為15% ～20%)，但是傳統(tǒng)的放射性肺損傷防治方法都存在很大的弊端，所以新的防治手段亟待提出。亞低溫在神經(jīng)系統(tǒng)等方面的保護作用已被廣泛研究，并應用于顱腦損傷、心胸外科、急性肺損傷等領域[3]，但在放射性肺損傷防治方面報道較少。因此，本實驗擬通過X線模擬機定位，直線加速器照射復制大鼠放射性肺損傷模型，并給予亞低溫干預，觀察并比較亞低溫與臨床常用藥氨磷汀對放射性肺損傷的防護效果，期望能夠?qū)喌蜏胤乐畏派湫苑螕p傷提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

6～8周齡SPF級雄性SD大鼠75只，體重(205±15)g，由北京維通利華實驗動物公司提供【SCXK(京)2016-0006】。動物飼養(yǎng)于中國輻射防護研究院GLP中心動物實驗室【SYXK(晉)2013-0002】。

1.1.2 主要儀器與設備

Elekta Synergy型醫(yī)用電子直線加速器、SL-IE型放射治療模擬機由山西大醫(yī)院放療科提供；H0-3多通道溫度巡檢儀、福意聯(lián)恒溫箱、石蠟包埋機、石蠟切片機、全自動組織脫水機、CX21型生物顯微鏡(Olympus)、酶標儀等由中國輻射防護研究院毒理室提供。

1.1.3 主要試劑

注射用氨磷汀注射液(開封明仁藥業(yè)有限公司)；超氧化物歧化酶、還原型谷胱甘肽、丙二醛測定試劑盒、Masson染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)；腫瘤壞死因子(TNF-α)Elisa試劑盒，細胞凋亡檢測試劑盒，DAB染色試劑盒(博士德生物)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

75只SD大鼠隨機分為5組：空白對照組、單純照射組、氨磷汀陽性組、亞低溫預防組、亞低溫治療組，每組15只。每5只一組分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 模型建立及亞低溫干預

10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，在X線模擬機下定位照射野(全肺)，并標記；用12 MeV電子線[4]進行20 Gy垂直單次照射，源皮距100 cm，照射深度3 cm，劑量率300 cGy/min?？瞻讓φ战M單純麻醉，不進行照射；單純照射組在麻醉后進行定位及射線照射；氨磷汀陽性組在照射前0.5 h內(nèi)腹腔注射氨磷汀(150 mg/kg)[5]；亞低溫預防組在麻醉后預先用冰袋使動物體溫降至(34±1)℃范圍內(nèi)即行射線照射并維持亞低溫6 h；亞低溫治療組在照射后立即將大鼠置于可調(diào)節(jié)溫箱中，使其體溫維持在(34±1)℃范圍內(nèi)并持續(xù)6 h[6]。除亞低溫實驗組外其余各組動物體溫一律保持在正?；A體溫內(nèi)，體溫用多通道肛溫儀監(jiān)測，并用恒溫箱調(diào)控。

1.2.3 標本取材及處理

于照射后6 h、14 d和35 d共3個時間點各組麻醉處死5只大鼠，腹主動脈取血并于-80℃保存，稱取全肺組織重量，計算肺系數(shù)(肺質(zhì)量mg/體重g×100%)。取各大鼠右肺前葉迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，病理取材，石蠟包埋后行HE及Masson染色，觀察病理組織學的變化，其余肺組織分裝后于-80℃中保存。檢測血清中的SOD、MDA、GSH含量；凋亡檢測試劑盒觀察各組大鼠肺組織凋亡情況；檢測各組肺組織勻漿中細胞因子TNF-α含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較方差齊時采用Bonferroni方法檢驗，方差不齊時用Games-Howell方法檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

空白對照組大鼠正常生長，無不良反應發(fā)生；單純照射組大鼠在照射7 d后皮膚毛躁，相對于空白對照組活動遲緩，在14 d左右出現(xiàn)胸毛脫落現(xiàn)象，在照射后第35天呼吸頻率明顯加快，胸部毛發(fā)脫落嚴重；氨磷汀陽性組及亞低溫組相對于單純照射組癥狀較輕。空白對照組大鼠肺組織表明光滑，呈粉紅色，彈性良好；照射后第14天單純照射組大鼠肺部顏色發(fā)暗，外形無明顯變化，氨磷汀組及亞低溫組差異不大，見圖1；照射后第35天單純照射組大鼠肺部明顯腫脹增大，顏色發(fā)紫并有白色結(jié)節(jié)，氨磷汀組及亞低溫預防組也有輕微小結(jié)節(jié)，肺組織顏色加深，見圖2，大鼠肺系數(shù)結(jié)果見表1，第35天時，單純照射組的肺系數(shù)明顯提高，氨磷汀組和亞低溫預防組都有所降低(P< 0.05)，肺組織失代償性增大，而各干預能改善其肺功能。

2.2 肺組織病理組織學及膠原沉積觀察

正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，各級支氣管、肺泡管、肺泡囊及肺泡間隔結(jié)構(gòu)正常，未見充血、水腫，炎細胞浸潤等改變。照射后當天，各組肺組織病理鏡檢均未見異常；在照射后第14天，單純照射組肺泡結(jié)構(gòu)改變伴中度纖維化出現(xiàn)，陽性對照組及亞低溫預防組有中度纖維化但無肺泡間隔結(jié)構(gòu)改變，亞低溫治療組肺泡腔及支氣管壁輕度纖維化；照射后第35天，單純照射組肺泡及肺泡壁內(nèi)充滿炎性細胞并伴嚴重的肺泡壁結(jié)構(gòu)改變及纖維化，陽性組及亞低溫預防組纖維化程度加重，亞低溫治療組炎癥及纖維化程度也有所增加，程度較輕。如圖3、圖4。

注：從左至右依次為空白對照組、單純照射組、氨磷汀陽性組、亞低溫預防組、亞低溫治療組。圖1 照射后第14天肺組織肉眼觀察Note. From left to right: Control group, Model group, Amifostine group, Mild hypothermia prevention group, and Mild hypothermia treatment group, respectively.Figure 1 Lung tissues at 14 d after irradiation

注：從左至右依次為空白對照組、單純照射組、氨磷汀陽性組、亞低溫預防組、亞低溫治療組。圖2 照射后第35天肺組織肉眼觀察Note. From left to right: Control group, Model group, Amifostine group, Mild hypothermia prevention group, and Mild hypothermia treatment group, respectively.Figure 2 Lung tissues at 35 days after irradiation

注：A.空白對照組；B.單純照射組；C.陽性對照組；D.亞低溫預防組；E.亞低溫治療組。圖3 照射后第14天肺組織病理變化(HE染色，×200)Note. (A) Control group. (B) Model group. (C) Amifostine group. (D) Mild hypothermia prevention group. (E) Mild hypothermia treatment group.Figure 3 Pathological changes in the rat lung tissues at 14 d after irradiation(HE staining, ×200)

注：A.空白對照組；B.單純照射組；C.陽性對照組；D.亞低溫預防組；E.亞低溫治療組。圖4 照射后第35天肺組織病理變化(HE染色，×200)Note. (A) Control group. (B) Model group. (C) Amifostine group. (D) Mild hypothermia prevention group. (E) Mild hypothermia treatment group.Figure 4 Pathological changes in the rat lung tissues at 35 d after irradiation (HE staining, ×200)

Masson染色陽性是指肺泡及肺泡間隔內(nèi)出現(xiàn)藍染條索狀物，為增生的膠原纖維組織。如圖5、圖6觀察可見：照射后14 d時單純照射組的膠原沉積較多，各干預組有少量沉積；照射后35 d時單純照射組膠原含量增加，氨磷汀組及亞低溫組膠原含量略有升高，程度較輕。提示亞低溫干預溫能減輕放射性肺炎及纖維化的發(fā)生、發(fā)展程度，與氨磷汀防護效果相近。

2.3 不同時間點大鼠抗氧化能力

與正常對照組比較，各照射組SOD活性都有下降趨勢；與單純照射組比較，第14天時亞低溫治療組的SOD活性恢復明顯(P< 0.05)，第35天時氨磷汀陽性組及亞低溫治療組SOD活性回升，差異有統(tǒng)計學意義，恢復效果優(yōu)于亞低溫預防組；與單純照射組比較，陽性組及亞低溫干預組第14天血清中MDA含量均明顯降低(P< 0.05)，第35天單純照射組含量依然最高；各時間結(jié)點照射組的GSH含量都低于空白對照組，趨勢明顯。提示亞低溫在放射性肺損傷大鼠的抗氧化能力方面有較好的作用，結(jié)果列于表1。

2.4 輻照后大鼠肺組織中細胞因子TNF-α含量變化

照射后6 h除空白對照組維持在正常水平外，其余各組TNF-α含量迅速升高，其中單純照射組升高明顯，氨磷汀陽性組及亞低溫治療組與單純照射組相比，上升程度較低(P< 0.05)；照射后第14天，各受照組仍處于較高水平，相較于照射后6 h略有下降，但各組間差異不明顯，見表2，表明亞低溫治療組在輻照前期對炎癥細胞因子有很好的抑制作用。

2.5 大鼠肺組織中細胞凋亡改變

利用免疫組化對細胞凋亡部位進行染色，陽性部位為細胞核。照射后當天，各組肺組織病理鏡檢均未見陽性，單純照射組肺泡上皮有多量細胞核呈棕黃色陽性，陽性組及亞低溫治療組有較多細胞核呈棕黃色，亞低溫預防組有極少量細胞核呈棕黃色。觀察顯示單純照射組發(fā)生細胞凋亡更加明顯，各干預組有所下降，亞低溫預防組凋亡細胞最少。各組鏡下觀察如圖7。

注：A.空白對照組；B.單純照射組；C.陽性對照組；D.亞低溫預防組；E.亞低溫治療組。圖5 照射后第14天肺組織病理變化(Masson染色，×400)Note. (A) Control group. (B) Model group. (C) Amifostine group. (D) Mild hypothermia prevention group. (E) Mild hypothermia treatment group.Figure 5 Pathological changes in the rat lung tissues at 14 d after irradiation(Masson staining, ×400)

注：A.空白對照組；B.單純照射組；C.陽性對照組；D.亞低溫預防組；E.亞低溫治療組。圖6 照射后第35天肺組織病理變化(Masson染色，×400)Note. (A) Control group. (B) Model group. (C) Amifostine group. (D) Mild hypothermia prevention group. (E) Mild hypothermia treatment group.Figure 6 Pathological changes of the rat lung tissues at 35 d after irradiation(Masson staining, ×400)

注：A.空白對照組；B.單純照射組；C.陽性對照組；D.亞低溫預防組；E.亞低溫治療組。圖7 照射當天肺組織細胞凋亡(TUNEL染色，×200)Note. (A) Control group. (B) Model group. (C) Amifostine group. (D) Mild hypothermia prevention group. (E) Mild hypothermia treatment group.Figure 7 Cell apoptosis in the lung tissues on the day of irradiation(TUNEL staining, ×200)

表1 不同時間點大鼠各實驗參數(shù)比較Table 1 Comparison of the experiment parameters of rats at different time points n=15)

注：與單純照射組比較,*P< 0.05；與空白對照組比較▲P< 0.05。

Note. Compared with Model group,*P< 0.05. Compared with Blank group,▲P< 0.05.

表2 肺組織勻漿中TNF-α含量Table 2 Tumor necrosis factor α content in lung homogenates at different time points n=10)

注：與單純照射組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with Model group,*P< 0.05.

3 討論

放射性肺損傷有兩種表現(xiàn)形式：放射性肺炎和放射性肺纖維化。關(guān)于這兩種形式的出現(xiàn)時間及關(guān)聯(lián)一般認為[7]，放射性肺纖維化是由急性放射性肺炎發(fā)展而來，是損傷的第二個階段。通過實驗，照射后第14天時單純照射組肺組織炎癥反應明顯，亞低溫干預能減輕組織炎癥，照射后第35天時單純照射組有明顯的纖維化出現(xiàn)，氨磷汀和亞低溫干預都能減輕纖維化的程度，有防護放射性肺損傷的作用。

放射性肺損傷的發(fā)病機制主要為：經(jīng)過射線照射后超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等自由基清除酶活性降低，會使自由基清除出現(xiàn)障礙導致自由基的大量蓄積，進而引發(fā)一系列生物膜脂質(zhì)過氧化反應損傷肺實質(zhì)；同時肺組織受到射線刺激后會釋放大量的炎癥細胞因子，誘導淋巴細胞等炎性細胞的滲出，其中TNF-α是體內(nèi)多種細胞因子的啟動因子[8]，可以誘導IL-6等其他細胞因子的合成釋放，產(chǎn)生瀑布效應，并能夠激活血小板、中性粒細胞等，進一步釋放氧自由基、脂質(zhì)代謝產(chǎn)物等介質(zhì)，加重肺組織損傷。亞低溫治療在心腦血管等外科手術(shù)中應用多年，對正常組織及各項生理指標幾乎沒有影響[9]。本實驗中，通過亞低溫的干預能明顯提高輻照大鼠的SOD活力，作為體內(nèi)最重要的抗氧化酶，改善機體清除自由基的能力意義重大；還原型谷胱甘肽是一種含巰基的還原劑[10]，可以通過減少氧自由基的含量發(fā)揮治療放射性肺損傷的作用，實驗中亞低溫治療組及氨磷汀陽性組都能夠很好的提高輻照后大鼠的GSH含量，效果相近；丙二醛是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應的終產(chǎn)物，能間接反應機體氧化的程度，實驗各干預組能明顯降低其含量，達到保護的作用，但各干預組保護效果相近，差異不明顯；作為放射性肺損傷的細胞前炎癥因子，TNF-α在輻照初期改變較大，氨磷汀及亞低溫干預能夠很大程度的減少其激活，降低損害機率；放射性肺損傷發(fā)生后，適度的細胞凋亡可以清除肺泡腔及間質(zhì)中異常增殖的炎性細胞以恢復肺組織正常結(jié)構(gòu)，但是過度的細胞凋亡，尤其是肺泡上皮細胞等框架細胞的過度凋亡會導致組織結(jié)構(gòu)的破壞，產(chǎn)生纖維化[11]，單純照射組中肺組織細胞大量凋亡，平衡破壞，而各干預組能夠降低凋亡細胞數(shù)，抑制凋亡。

氨磷汀是一種細胞毒性保護劑，通過抑制射線產(chǎn)生的過氧化物作用而減輕肺損傷，其防護作用在臨床上已經(jīng)被廣泛認可，但是在臨床應用過程中會出現(xiàn)胃腸道功能失調(diào)、低血壓、低鈣性手足搐愵等不良反應[12]，這也就需要我們?nèi)フ业礁玫姆雷o方法。本次實驗很好的復制了大鼠放射性肺損傷模型，并且通過干預發(fā)現(xiàn)，氨磷汀組和亞低溫治療組在抗氧化及抗炎癥等方面都有明顯的防護作用，說明亞低溫治療在放射性肺損傷防治方面或可達到替代氨磷汀的實驗要求，為將亞低溫應用于臨床胸部腫瘤患者的放療防護提高了實驗基礎。

亞低溫治療方法在放射性肺損傷防護方面具有保護作用，但是具體的作用機制還不清楚，而且最佳的臨床應用條件也需要進一步摸索，這也為以后的研究提供了的思路。