宋立成，程浩，奐劍波，陳麗娜，韓志海

(中國人民解放軍海軍總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100048)

煙霧吸入性肺損傷是戰(zhàn)時或平時火災(zāi)中常見的致命性的損傷因素，是燒傷病人的獨立預(yù)測因子，特別是在表面燒傷面積大于50%的病人中，其預(yù)計死亡率比不伴有吸入性損傷的病人高20%，如果繼發(fā)肺炎，死亡率超過60%[1]。雖然近年來針對煙霧吸入性損傷的機制研究及治療取得許多進展，但是由于艦船火災(zāi)現(xiàn)場的復(fù)雜環(huán)境、不同類型材料燃燒形成的不同種類的煙霧成分、合并傷情的區(qū)別及煙霧吸入時間的長短等因素的差別，需要進一步研究探討，特別是隨著艙室內(nèi)建筑材料的日益豐富，燃燒產(chǎn)生的煙霧成分多達上百種，單純木材、棉花等模擬的煙霧損傷模型已難以模擬真實世界的傷情特點。既往的煙霧吸入導(dǎo)致肺損傷模型中，研究者曾采用多種類型動物進行試驗，包括成年犬、綿羊、豬、兔、嚙齒類動物等[2-3]，大鼠具有操作簡便、易獲取、應(yīng)用范圍廣等特點，可以模擬大批煙霧吸入性肺損傷傷情特點的分析，是目前各種類型肺損傷中常用的實驗動物[4-5]。本研究構(gòu)建等比例模擬艦船艙室，以成年SD大鼠為實驗動物，以艦船火災(zāi)常見的7種復(fù)合材料作為燃燒物，模擬真實世界艦船火災(zāi)發(fā)生后煙霧吸入情況，通過建立穩(wěn)定的恒溫?zé)熿F吸入性肺損傷模型，為進一步研究室內(nèi)火災(zāi)的真實情況奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

1.1.2 主要實驗試劑

PierceTMBCA 蛋白檢測試劑盒(Thermo，23225)，抗-IL6 抗體(Abcam，ab9324)，抗-IL10 抗體(Abcam，ab9969)，抗-TNF α抗體 (Abcam，ab6671), 抗-Myeloperoxidase抗體(Abcam，ab208670), 抗-p38抗體[M138] (Abcam，ab31828), 抗-Erk1/2抗體(Abcam，ab50011), 抗-NF-kB p65抗體(Abcam，ab16502), 山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor? 568) (Abcam，ab175471)。

1.1.3 主要實驗儀器

電泳儀(DYY-5D型，中國)，離心機(Thermo Pico17，美國)，電熱恒溫干燥箱(上海上邁電子儀器有限公司，中國)，恒溫水浴鍋(XMTD-7000型，中國)，水平空氣搖床(北京市沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司，中國)，倒置熒光顯微鏡(Olympus IX73, 日本)，血氣分析儀 (ABL800 Radiometer, 丹麥)，全自動生化分析儀(貝克曼庫爾特AU680，美國)，可燃有毒有害氣體探測儀(瑞凱雷PNT400，中國)。

④ 按照以上方法，7×0.5表示怎樣的含義？7×0.1，15×0.1呢？此環(huán)節(jié)設(shè)計的目的是讓學(xué)生學(xué)會用乘法分配律的性質(zhì)將小數(shù)運算變形，進而去理解小數(shù)乘法多方面的意義.同時習(xí)得此方法，將其運用到任意的小數(shù)乘法.

1.2 方法

1.2.1 自制煙霧產(chǎn)生裝置

(1)裝置的組成及原理：本次實驗采用自行研制的密封性良好的產(chǎn)煙裝置和實驗裝置一體化的集成系統(tǒng)，主要組成部分為煙霧生成單元(不銹鋼材質(zhì)，內(nèi)含1個控溫電磁爐、4個排風(fēng)扇、1個溫度檢測器，一個煙霧成分檢測器)，動物染毒單元(艦船艙室模擬箱，不銹鋼材質(zhì)，包含一個水循環(huán)冷卻系統(tǒng)，可控制箱內(nèi)溫度20～25℃，1個溫度檢測器，一個煙霧成分檢測器，單側(cè)箱體為玻璃材質(zhì)，可以實時監(jiān)測箱內(nèi)動物活動狀態(tài))。兩個單元通過聯(lián)通管道連接。

(2)煙霧吸入方案：經(jīng)本課題組現(xiàn)場調(diào)查研究，目前艦船內(nèi)裝常見的易燃材料有：聚雙馬泡沫材料、發(fā)泡橡塑絕熱制品、阻燃白膠、阻尼材料、無鹵電纜、硅丙乳膠漆、裝飾板這7種。將發(fā)煙材料研磨成粉等比例混合(各20 g)后，置于電磁爐上方的托盤中，控制電磁爐溫度為300℃，待產(chǎn)煙箱中煙霧充盈后用排風(fēng)機將煙霧通過管道排入試驗箱中，同時用煙氣檢測儀檢測箱內(nèi)氣體的濃度，各種氣體控制范圍為：CO 400～550 ppm，H2S 10～15 ppm,O218% ～20%，上述成分的含量通過控制排風(fēng)機進行維持。

1.2.2 實驗流程設(shè)計

(1)不同煙霧吸入時間組：80只大鼠隨機分為4組，對照組20只，煙霧吸入15 min組20只，煙霧吸入30 min組20只，煙霧吸入50 min組20只，觀察7 d，記錄每組的生存情況，計算生存曲線。

(2)穩(wěn)定煙霧吸入時間組：以煙霧吸入30 min為實驗組，120只大鼠于煙霧吸入后根據(jù)存活時間(T=1，6，24 h)隨機分為3組，每組各30只，對照組大鼠30只，在相應(yīng)時間點，用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后進行標(biāo)本采集。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)

抽取動脈血氣后的大鼠放血致死，從大鼠胸正中線開胸后分離并夾閉氣管，剝離大血管，完整取出全肺，結(jié)扎右主支氣管，取長4 cm、22 g硅膠管行氣管插管灌注冷無菌生理鹽水行左肺灌洗，1 mL注入，緩慢回抽3次，回收0.4～0.6 mL，其中抽取10 μL滴于細胞計數(shù)板上于顯微鏡下進行細胞計數(shù)，剩余灌洗液先以1500 r/min離心3 min，沉淀進行細胞分類，上清液再次以3000 r/min 4℃離心10 min。BALF中的蛋白質(zhì)含量通過微量BCA蛋白試劑盒測定。

1.3.2 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(Western blot，WB)檢測

將液氮中的肺組織取出后進行低溫下研磨，使用RIPA 裂解肺組織研磨液，冰上孵育30 min后，收集裂解細胞的液體， 4℃離10 min，留取上清，蛋白定量至5 g/L，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，封閉液孵育2 h后，加入MPO單抗、IL-6單抗、IL-10單抗、TNF-α單抗、ERK 1/2單抗、P38單抗或P65單抗4℃孵育過夜，洗膜，與二抗室溫孵育1 h，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.3.3 免疫熒光

液氮中的肺組織經(jīng)冰凍切片后，用5%的胎牛血清封閉，分別用ERK 1/2、P38、P65作為一抗染色1 h；然后用山羊抗鼠IgG (H+L) Alexa Fluor 568染色1 h；細胞核用DAPI進行染色；用熒光顯微鏡捕捉圖像。

1.3.4 血氣分析

將大鼠麻醉后，暴露腹主動脈用血氣針進行采血，檢測指標(biāo)為PH、氧分壓、二氧化碳分壓、碳氧血紅蛋白、乳酸。

1.3.5 病理損傷評估

對右肺主支氣管進行結(jié)扎后，收集右肺下葉于4%的甲醛中，48 h后進行石蠟包埋，然后進行切片，厚度為6 μm，脫蠟后進行蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色，通過單盲法由兩名病理科醫(yī)生光鏡下進行組織學(xué)觀察。我們采用了美國胸科學(xué)會(American Thoracic Society，ATS)制定的肺損傷評分標(biāo)準(zhǔn)，參數(shù)包括肺泡內(nèi)中性粒細胞計數(shù)、肺泡間隔內(nèi)中性粒細胞計數(shù)、透明膜形成與否、肺泡腔內(nèi)是否殘存蛋白質(zhì)、肺泡間隔的厚度。每個病理醫(yī)生對每張切片至少選取20個隨機高倍視野(400× total magnification) 進行評分。

1.3.6 肝腎功能評估

對照組和煙霧吸入后1，6，24 h的各組大鼠通過腹主動脈收集全血1 mL至檸檬酸鈉抗凝管中(血液與抗凝劑比例為9∶1)。全血于4℃中離心10 min(3000 r/min)，收集血漿，通過全自動生化檢測儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、白蛋白、球蛋白、血肌酐、尿素氮。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同煙霧吸入時間對生存率的影響

煙霧吸入15 min(A組)、30 min(B組)、50 min(C組)各20只大鼠，觀察時間段為48 h。A組總體生存率為84.21%；B組總體生存率為25%，其中煙霧吸入后的前6 h內(nèi)生存率變化最顯著(43.75%)；C組現(xiàn)場死亡17只，煙霧吸入后1 h死亡2只，3 h死亡一只，總體生存率為0(圖1)。

圖1 不同煙霧吸入時間對24 h生存率的影響Figure 1 Survival rate for different smoke inhalation times at 24 h recovery

2.2 動脈血氣分析的變化

對煙霧吸入30 min組進行進一步分析，煙霧吸入后的1 h，氧分壓下降，與對照組相比，差異有顯著性(P< 0.01)，6 h氧分壓繼續(xù)下降，24 h逐漸回升；碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin，COHB)于煙霧吸入后立即升高，與對照組相比，差異有顯著性(P< 0.01)，6 h已出現(xiàn)顯著下降，24 h時與對照組相比，差異無顯著性。二氧化碳分壓的變化與氧分壓變化的趨勢相同。動脈血乳酸于煙霧吸入后1 h內(nèi)顯著增高，與對照組相比，差異有顯著性(P< 0.01)，在6 h及24 h基本恢復(fù)正常，與對照組相比，差異無顯著性(P> 0.05)。(表1)

表1 煙霧吸入后不同時間組血氣的變化情況Table 1 Changes in blood gas parameters after smoke n=10)

注：與對照組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group，*P< 0.05.

2.3 外周血白細胞變化

外周血白細胞于煙霧吸入后1 h內(nèi)較對照組出現(xiàn)顯著升高(P< 0.01)，于6 h達到高峰，24 h逐漸下降，與對照組相比，差異有顯著性(P< 0.01)；中性粒細胞于煙霧吸入后第6 h達到最高值, 與對照組相比P< 0.01，此時中性粒細胞比例也達到最高值。(圖2)

注：A. 煙霧吸入后外周血白細胞(WBC)、中性粒細胞(neu)、淋巴細胞(lym)、單核細胞(mon)計數(shù)的變化情況；B. 煙霧吸入后中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞比例的變化情況。與對照組相比，**P< 0.01，*P< 0.05。圖2 煙霧吸入后外周血白細胞數(shù)量及比例變化情況Note. A. Counts of circulating white blood cells, neutrophil, lymphocytes, and monocytes after smoke inhalation. B. Percentages of circulating neutrophils, lymphocytes, and monocytes after smoke inhalation. **P < 0.01, *P < 0.05, compared with the control group.Figure 2 Changes in cell counts and proportion of peripheral blood leukocytes after smoke inhalation

2.4 BALF中白細胞及蛋白含量變化

通過測定BALF中白細胞總數(shù)及細胞分類和蛋白含量來評估肺損傷嚴(yán)重程度。結(jié)果提示，與對照組相比，煙霧吸入后BALF中白細胞總數(shù)顯著增高，煙霧吸入后不同時間組之間差異無顯著性；白細胞分類結(jié)果顯示，對照組細胞分類以巨噬細胞為主，而煙霧吸入后，隨著時間變化，巨噬細胞比例先降低再升高；中性粒細胞于煙霧吸入6 h后其比例達到最高，此后逐漸降低。(圖3)

注：A. 煙霧吸入后BALF內(nèi)白細胞總數(shù)的變化情況；B. 煙霧吸入后BALF內(nèi)巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞比例的變化情況。與對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖3 煙霧吸入后BALF內(nèi)白細胞總數(shù)及比例的變化情況Note. A. White blood cell counts in BALF after smoke inhalation. B. Percentages of neutrophils, lymphocytes, and macrophages in BALF after smoke inhalation. **P < 0.01, *P < 0.05， compared with the control group.Figure 3 Changes in cell counts and leukocyte ratio in the BALF after smoke inhalation

2.5 煙霧吸入后組織病理學(xué)變化

煙霧吸入后，BALF內(nèi)蛋白含量顯著升高；肺組織病理切片提示煙霧吸入后1 h內(nèi)出現(xiàn)彌漫性肺泡內(nèi)水腫，伴有巨噬細胞廣泛聚集；6 h肺泡內(nèi)出血明顯加重，中性粒細胞逐漸增加；24 h可見肺泡內(nèi)水腫液逐漸減少，肺泡間隔明顯增厚，中性粒細胞比例下降，巨噬細胞比例開始升高。肺損傷評分顯示，煙霧吸入后1 h內(nèi)出現(xiàn)顯著肺損傷，一直持續(xù)至24 h，與肺損傷最嚴(yán)重的第6 h相比，差異有顯著性(P值均小于0.01)。(圖4、5)

注：A. 煙霧吸入后BALF內(nèi)蛋白濃度的變化情況；B. 煙霧吸入后肺損傷評分的變化情況。與對照組相比，**P< 0.01。圖4 煙霧吸入后BALF內(nèi)蛋白濃度及肺損傷評分的變化Note. A. Protein concentrations in BALF after smoke inhalation. B. Lung injury scores after smoke inhalation. **P < 0.01 compared with the control group.Figure 4 Changes in protein concentrations in the BALF and lung injury scores after smoke inhalation

注：A-D分別為對照組肺組織、煙霧吸入后1、6、24 h肺組織的H&E染色。圖5 煙霧吸入后肺組織病理學(xué)變化(×400)Note. A-D. The groups of control, and 1, 6, and 24 h post smoke inhalation.HE stainingFigure 5 Histopathology of the lung tissues after smoke inhalation (×400)

圖6 免疫熒光顯示煙霧吸入后通路信號分子P42/44 MAPK、P38 MAPK、NF-κB P65隨時間變化表達情況Figure 6 Expression of P42/44 Mitogen-activated protein kinase (MAPK), P38 MAPK, and nuclear factor -kappaB (NF-κB) P65 after smoke inhalation by immunofluorescence assay

2.6 三條主要信號通路蛋白的變化

western blot及免疫熒光結(jié)果顯示，煙霧吸入后，ERK、P65、P38在肺泡I型、II型上皮細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞等部位均有廣泛的表達，第6 h表達最顯著，第24 h后表達量逐漸降低。(圖6、7)

2.7 炎癥因子表達的變化

Western blot結(jié)果顯示，煙霧吸入后1 h即可出現(xiàn)IL-6的升高，IL-10、TNF-α及MPO在6 h出現(xiàn)顯著升高，各炎癥因子均在6 h升高最為顯著，24 h略有下降。(圖7)

2.8 肝腎功能變化

煙霧吸入后第1 h，谷丙轉(zhuǎn)氨酶出現(xiàn)一過性升高，與對照組相比差異有顯著性(P< 0.05)，第6 h及第24 h逐漸恢復(fù)，與對照組相比，差異無顯著性；總膽紅素在對照組和煙霧吸入后各組之間無顯著性差異；總蛋白在煙霧吸入后1 h顯著增高，第6 h稍降低，與對照組相比，差異有顯著性(P< 0.01)；白蛋白及球蛋白的變化與總蛋白呈相同的趨勢；腎功能在煙霧吸入前后均無統(tǒng)計學(xué)差異。(表2，3)

3 討論

無論是森林火災(zāi)、室內(nèi)火災(zāi)煙霧還是其他類型的煙霧，其成分是復(fù)雜多樣的[6-8]，致傷因素也各不相同。艦船火災(zāi)是威脅艦艇及船員生命力的極其重要因素，而由于存在空間密閉、狹小，可燃物多，毒性大等現(xiàn)實情況，肺損傷的嚴(yán)重程度及病理生理變化需要進一步探討。

煙霧吸入后產(chǎn)生強烈的復(fù)雜的炎癥反應(yīng)，局部表現(xiàn)包括支氣管、血管痙攣、支氣管粘液溢、肺泡淹溺、支氣管滲出、支氣管內(nèi)鑄型、通氣血流失衡。氣管內(nèi)大量的液體滲出造成有效循環(huán)量的降低[9]。據(jù)統(tǒng)計，伴有吸入性損傷的燒傷病人，所需的液體復(fù)蘇量較不伴有吸入性損傷的病人顯著增高[10]。

圖7 煙霧吸入后通路信號分子P42/44 MAPK、P38 MAPK、NF-κB P65及炎癥因子IL-6、IL-10、MPO、TNF-α隨時間變化表達情況Figure 7 Expression of interleukin-6(IL-6), IL-10, TNF-α, P42/44 MAPK, P38 MAPK, Myeloperoxidase (MPO), and NF-κB P65 after smoke inhalation detected by Western blot

表2 煙霧吸入后不同時間組肝功能的變化情況Table 2 Changes in liver function after smoke n=10)

注：與對照組比較，*P< 0.05.

Note. TBil, total bilirubin；ALT, alanine aminotransferase；TP, total protein；ALB，albumin, GLB, globulin. Compared with the control group，*P< 0.05.

表3 煙霧吸入后不同時間組腎功能的變化情況Table 3 Changes in renal function

注：與對照組比較，P>0.05.

Note. CRE, creatinine; BUN, blood urea nitrogen. Compared with the control group，P>0.05.

我們通過對不同煙霧吸入時間的比較發(fā)現(xiàn)，短期煙霧吸入與長期煙霧吸入生存率存在顯著差別，提示煙霧吸入后應(yīng)盡早脫離煙霧環(huán)境能顯著降低死亡率。對煙霧吸入后的早期死亡大鼠(6 h內(nèi)死亡)進行解剖，結(jié)果提示，早期死亡最重要的因素是大量水腫液溢出導(dǎo)致的大氣道阻塞，以及肺泡的淹溺使大鼠窒息死亡。因此，如何在早期通過藥物或機械手段有效緩解煙霧吸入急性期的肺水腫或通暢氣道，避免大量水腫液淹溺肺泡及阻塞氣道是急性期治療的一個關(guān)鍵問題。

肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages，AM)是肺組織重要組成部分，外源性刺激物及病原體可以引起AM表型和功能的改變[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，煙霧吸入初期巨噬細胞仍有較高比例，隨著氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的發(fā)展，中性粒細胞向肺泡內(nèi)的分泌逐漸增多。煙霧吸入后存在顯著的巨噬細胞為優(yōu)勢的BALF向中性粒細胞為優(yōu)勢的BALF的轉(zhuǎn)變，可以導(dǎo)致后期的免疫失衡、感染蔓延[13]。但后期由于肺泡巨噬細胞的凋亡以及間質(zhì)內(nèi)肺泡巨噬細胞的補充，導(dǎo)致隨時間發(fā)展呈先降低后升高的趨勢，其中巨噬細胞表型變化、吞噬及分泌功能的改變是我們下一步建立在此模型基礎(chǔ)上的研究的重點。對M1/M2平衡在肺部炎癥性疾病中具體機制的研究，有利于臨床發(fā)現(xiàn)潛在的藥物作用靶點。

對肺內(nèi)炎癥細胞及肺損傷評分等分析發(fā)現(xiàn)本模型損傷最嚴(yán)重的時間點是煙霧吸入后第6 h，故本模型總體采用煙霧吸入后1、6、24 h作為急性期研究的三個時間點，同時對煙霧吸入導(dǎo)致體內(nèi)多種炎性細胞激活后釋放出的TNF-a、IL-10、IL-6、核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extra-cellular signal-regulated kinases, ERKs)、P38及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)等在內(nèi)的多種炎性介質(zhì)及信號通路進行研究[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)上述通路在煙霧吸入后顯著表達，而這些通路在調(diào)節(jié)巨噬細胞極化過程中均發(fā)揮重要作用，并且與M1相關(guān)的IL-6及與M2相關(guān)的IL-10也存在過表達的現(xiàn)象，這些均提示巨噬細胞的活化參與肺損傷調(diào)節(jié)的過程。具體機制是我們下一步的研究重點。

MPO主要由活化的中性粒細胞分泌，而且是中性粒細胞中含量最高的蛋白[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，煙霧吸入后肺組織中MPO出現(xiàn)明顯的升高，并且與BALF中中性粒細胞變化趨勢相同，外周血中性粒細胞于煙霧吸入后也呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢，這與其他煙霧吸入模型中中性粒細胞大量聚集的趨勢相同[17]，因此，如何降低中性粒細胞聚集造成的損傷是煙霧吸入性肺損傷治療的一個靶點。

本次實驗的另一項發(fā)現(xiàn)是煙霧吸入急性期不伴有實質(zhì)性的腎功能損害。肌酐與尿素氮檢測提示煙霧吸入后24 h內(nèi)與對照組相比無顯著差異，而肝功能檢測提示，總蛋白、白蛋白、球蛋白及ALT于煙霧吸入后1 h顯著升高，此后逐漸降低并恢復(fù)正常，總膽紅素?zé)o顯著改變，考慮到煙霧吸入后出現(xiàn)嚴(yán)重肺水腫，大量循環(huán)中的液體滲入肺實質(zhì)中[18]，所以上述物質(zhì)急性期的升高很可能與循環(huán)血量迅速降低導(dǎo)致的血液濃縮有關(guān)，隨著大鼠自行進食、進水，及肺水腫的自行吸收，上述指標(biāo)可很快恢復(fù)，故本研究認(rèn)為煙霧吸入急性期并不引發(fā)肝腎功能的損害。

本模型存在燃燒成分、染毒空間等方面的不同，對動物造成的損傷接近真實世界艦艇火災(zāi)現(xiàn)場情況，并且本模型重復(fù)性好，監(jiān)測數(shù)據(jù)全面，可以作為煙霧吸入肺損傷機制研究的平臺。