張蕊，易月娥，杜牧，趙蕾，張惠銘，左從林

(北京昭衍新藥研究中心，北京 100176)

很多動物包括大鼠、小鼠、倉鼠和犬等都可以肝內(nèi)膽管增生，特別是大鼠更易發(fā)生病變。文獻報道老齡大鼠膽管增生的發(fā)病率很高，在不同種屬、不同性別大鼠中，其發(fā)生率有較大的差異[1-3]。膽管細胞正常狀態(tài)下是處于分裂靜止期的，但其具備分裂潛能，在受到外界刺激、損傷和其他因素作用時可以發(fā)生増生。在毒性病理學研究當中，實驗動物也可見到與藥物毒性相關的膽管增生病變[1]。膽管細胞增生病變在病理形態(tài)上呈現(xiàn)多樣化，其病因和發(fā)病機制尚不明確。本研究通過觀察不同種屬和性別老齡大鼠自發(fā)性膽管增生性病變，以求進一步探索大鼠自發(fā)性膽管增生的發(fā)病規(guī)律和病理學特點，旨在為相關科研及新藥安全評價工作積累大鼠肝膽管增生的有價值的研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

進口無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級SD大鼠60只，購自日本CLEA公司；國產(chǎn)SPF級SD大鼠120只，國產(chǎn)SPF/無病毒抗體VAF(virus antibodies free，VAF)級Wistar大鼠120只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(京)2006-0009】。實驗動物均雌雄各半，周齡4～5周，體重50～70 g。

1.1.2 飼養(yǎng)條件

動物飼養(yǎng)于本中心SPF級動物房【SYXK(京)2009-0024】，動物房室溫20～25℃，濕度40% ～70%，光照12 h明暗交替。動物給予進口飼料，輻照滅菌實驗動物鼠用飼料美福18(MF18)購自東酵(上海)商貿(mào)有限公司。動物自由攝食飲水。

1.1.3 儀器和試劑

全封閉式組織脫水機(Asp300，LAICA，美國)、組織包埋機(EG1150H，LAICA，美國)、半自動輪轉切片機(RM2235，LAICA，美國)、攤片烤片一體機(CS-VI，LAICA，美國)、全自動染色封片一體機(CV5030，LAICA，美國)，恒溫烤箱(DRP-9082，中國)，生物顯微鏡(CX31，奧林巴斯，日本)，二甲苯、乙醇(北京化工廠，中國)，蘇木素、伊紅(北京世濟合力生物科技有限公司，中國)。

1.2 動物分組及方法

將300只大鼠分為3組，第1組雌雄各30只，其余各組雌雄各60只。分別為進口SD大鼠(組1)；國產(chǎn)SD大鼠(組2)；國產(chǎn)Wistar大鼠(組3)。

動物自由攝食、水。實驗第104周對存活動物實行安樂死。對所有發(fā)現(xiàn)死亡、瀕死安樂死及104周安樂死動物進行系統(tǒng)尸檢，并對所有動物肝進行病理學檢查。

所有動物肝經(jīng)4%甲醛固定后，進行取材、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色和顯微鏡觀察。 另外，對膽管增生病變實行Masson染色以觀察纖維增生。對膽管增生細胞進行免疫組織化學染色：選用兔抗大鼠細胞角蛋白(CK19，博士德生物)；兔抗大鼠波形蛋白(Vimentin, 博士德生物)；二抗是辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(康為世紀)。

1.3 統(tǒng)計學方法

所得數(shù)據(jù)采用 SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，利用卡方檢驗比較各項指標間差異，P< 0.05 認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 組織學檢查結果

2.1.1 實驗動物肝膽管增生的發(fā)生

本實驗結果顯示，發(fā)生膽管增生的動物有35只為實驗104周安樂死動物，其他發(fā)生膽管增生的動物除12只大鼠為實驗56～75周發(fā)生死亡，另50只動物均為實驗76～104周發(fā)生死亡。死亡原因多為腫瘤或慢性腎病導致。開放飼養(yǎng)條件下，大鼠壽命為2.5～3年，無菌大鼠壽命可達4年，以人60歲為老年年齡，大鼠進入老年的相應時間為1.7年，即20個月。本實驗于大鼠4～5周齡進入觀察期。而發(fā)生髓外造血的動物有89只動物為實驗76～103周發(fā)生死亡或實驗104周安樂死動物。上述結果可以看出，發(fā)生肝膽管增生的大鼠87.63%為老齡大鼠。

2.1.2 膽管增生病變的分級

通過對老齡大鼠肝組織進行HE染色顯微鏡下觀察，根據(jù)肝膽管增生的病變范圍和程度，將病變分成三個級別，即I 級、II級和 III 級。I級病變特征是：在取材的兩片長約1.5～2.0 cm的肝組織中，選擇其中一片膽管增生較明顯的進行觀察記錄，膽管增生病灶≤15個即判為I級；II級病變其膽管增生病灶在15～25個之間；III 級病變其膽管增生灶≥25個。結果顯示病變I級的發(fā)病動物數(shù)為61例，占62.9%；病變II級的發(fā)病動物數(shù)為21例，占21.6%；病變III級的發(fā)病動物數(shù)為15例，占15.5%。從上述結果中可以看出，存活兩年左右的大鼠的膽管增生，多數(shù)是處在I級和II級的狀況，少數(shù)發(fā)展到第III級病變階段。

2.1.3 膽管增生病變的組織學分類

根據(jù)膽管增生病變特點，將膽管增生病理改變總結為6個種類：第一類：匯管區(qū)內(nèi)或附近灶狀膽管增生，膽管數(shù)量增多，增生的膽管上皮細胞胞核/胞質(zhì)比例增大，膽管管腔擴張，很少見到纖維組織增生，視為早期增生性病變(見圖1B和C)；第二類：匯管區(qū)內(nèi)或附近灶狀膽管增生，膽管數(shù)量增多，增生的上皮細胞胞核/胞質(zhì)比例減小，胞核和胞質(zhì)均呈半透明狀(空泡化)，膽管周圍可見輕度纖維組織增生和炎細胞浸潤(見圖1D和E)；第三類病變：匯管區(qū)膽管增生伴膽管周圍顯著纖維組織增生，殘留的膽管上皮肥大，膽管呈半月形或分支狀吻合的腺管結構被向心層狀結締組織包繞，內(nèi)腔襯以單層細胞，這些細胞大小不一，似有異型性，類似一個小腸型的腺癌組織(見圖1F和G)；第四類病變：嚴重的纖維組織增生區(qū)發(fā)生玻璃樣變，增生的腺管消失(見圖1H和I)；第五類病變：膽管增生病變較多，纖維組織增生擴大，并與附近增生的膽管區(qū)相連接，形成早期肝硬化的趨勢(見圖1 J和K)。上述五種增生病變，有時候在I、II、III級分類的切片中均可以觀察到，說明三種病變的過程可以在肝反復發(fā)生；第六類病變：匯管區(qū)有細胞向肝實質(zhì)長入，細胞呈卵圓形、單排或雙排或團集狀增生，或形成不完整管腔樣結構，這些細胞胞質(zhì)少，嗜堿性染色增加，核呈卵圓形，被稱為卵圓形細胞(見圖1 L)。

卵圓形細胞的增生范圍和程度基本上與病變范圍和程度一致，且常常位于各種類型病變周圍(見圖2 A、B和C)。另外還觀察卵圓細胞常常伴隨著肝內(nèi)炎癥灶而明顯增生(見圖2D)。免疫組織化學檢測證明，這些增生的卵圓細胞呈角蛋白陽性(CK19)，但是對波形蛋白(vimentin)陰性(見圖2E和F)。

2.2 各組大鼠及不同性別大鼠膽管增生的發(fā)生率

在相同種屬的大鼠中，雄性動物自發(fā)性膽管增生的發(fā)生率高于雌性動物。對進口SD大鼠不同性別動物的自發(fā)性膽管增生的發(fā)生數(shù)量進行卡方檢驗，結果表明該種屬SD大鼠雌性及雄性的自發(fā)性膽管增生的發(fā)生數(shù)量差異無顯著性(df=1，χ2=1.017，P=0.313)；對國產(chǎn)SD大鼠不同性別動物的自發(fā)性膽管增生的發(fā)生數(shù)量進行卡方檢驗，結果表明該種屬SD大鼠雌性及雄性的自發(fā)性膽管增生的發(fā)生數(shù)量差異有顯著性(df=1，χ2=6.136，P=0.013)。國產(chǎn)Wistar大鼠不同性別動物的自發(fā)性膽管增生的發(fā)生數(shù)量進行卡方檢驗，結果表明該種屬Wistar大鼠雌性及雄性的自發(fā)性膽管增生的發(fā)生數(shù)量差異有顯著性(df=1，χ2=4.821，P=0.028)；對雌性大鼠、雄性大鼠總發(fā)生數(shù)量進行卡方檢驗，結果表明雄性大鼠與雌性大鼠的自發(fā)性膽管增生的發(fā)生數(shù)量差異有極顯著性(df=1，χ2=8.060，P< 0.01)。從上表中的結果可以看出，國產(chǎn)Wistar大鼠的自發(fā)性膽管增生發(fā)生率最高(53.33%)。分別對不同種屬大鼠膽管增生發(fā)生數(shù)量進行卡方統(tǒng)計，結果表明不同種屬大鼠膽管增生發(fā)生數(shù)量差異有極顯著性(df=2，χ2=51.74，P< 0.01)。見表1、2。

3 討論

Iwata 和 Hirouchi 曾經(jīng)觀察分析了750例老齡F344/Ducrj大鼠自發(fā)膽管增生情況，其中雄性發(fā)病率為94.5%，雌性發(fā)病率為32.4%，總發(fā)病率為63.4%[3]。本研究結果顯示300例老齡SD和Wistar大鼠也有較高的膽管增生發(fā)生率，其中雄性為40%，雌性為24.66%，總發(fā)病率為32.33%。盡管實驗的大鼠種屬不同，但本實驗結果再一次證明了老齡大鼠有較高的膽管增生發(fā)病率。至于兩個研究之間發(fā)病率的差異，可能與種屬、飼料以及飼養(yǎng)和實驗環(huán)境等因素相關。本研究還觀察到國產(chǎn)SD大鼠的發(fā)病明顯高于進口SD大鼠，國產(chǎn)Wistar 大鼠的膽管增生發(fā)病率也明顯高于國產(chǎn)SD大鼠，考慮這可能與動物種屬基因型差異的內(nèi)在規(guī)律相關。

注：A. 正常大鼠肝匯管區(qū)，可見匯管區(qū)內(nèi)的小葉間動脈、小葉間靜脈和小葉間膽管，一般可見1～3個小葉間膽管，×100； B. 匯管區(qū)內(nèi)大量膽管增生，匯管區(qū)增寬，膽管上皮細胞胞核/胞質(zhì)比例增大，管腔擴張，×100； C. 圖B的Masson 染色，無明顯纖維組織增生，×100； D. 匯管區(qū)膽管增生，上皮細胞胞核/胞質(zhì)比例減小，胞核和胞質(zhì)均呈半透明狀，膽管周圍可見輕度纖維組織增生和炎細胞浸潤，×100； E. 圖D的Masson染色，顯示纖維組織增生，×100； F. 匯管區(qū)膽管增生伴膽管周圍顯著纖維組織增生，殘留的膽管上皮肥大，膽管呈半月形或分支吻合狀，腺管被向心層狀結締組織包繞，內(nèi)腔襯以單層細胞，大小不一，類似于小腸腺癌，×400； G. 圖F的Masson 染色，×400； H. 纖維組織增生區(qū)發(fā)生玻璃樣變，腺管消失，×400； I. 圖H的Masson 染色，×400； J. 匯管區(qū)的纖維組織增生擴大，并與附近增生的匯管區(qū)接近和連接，形成肝硬化趨勢，×100； K.圖 J的Masson 染色，×100； L. 卵圓細胞增生并向跟小葉內(nèi)伸延，單排或雙排，細胞核卵圓形，染色深，胞質(zhì)少，×600。圖1 老齡大鼠膽管增生的組織病理學類型Note. (A). Normal potal area, with small arteries and vein and only three small bile ducts (×100). (B). Bile duct hyperplasia in the potal area, an enlarged potal area, and an increased ratio of epithelial nuclear and cytoplasm (x100). (C). No evidence of increased fibrosis from (B) Masson staining (x100). (D). Dcreased bile duct hyperplasia, and dcreased epithelial nuclear/cytoplasm ratio. Note the nuclear and cytoplasmic vacuolation, hyperplasia of fibrous tissues, and infiltration of inflammatory cells (×100). (E). Some fibrous tissues show proliferative changes compared with (D). Masson staining (×100). (F). Bile duct hyperplasia and a significant increase in fibrous tissues. Evidence of epithelial hypertrophy in the left bile duct, with a crescent or branch anastomosis shape. A glandular tube surrounded by concentric lamellar connective tissue, and monolayer cells lining the lumen (which varied in size), similar to that observed in the small intestines (×400). (G). Masson staining of (F) (×400); (H). Hyaline degeneration in potal area, and disappearance of the bile duct (×400). (I). Masson staining of (H) (x400). (J). Enlargement of the region of fibrous tissue proliferation in potal area, with connections to each other, indicating an early stage of liver cirrhosis (×100). (K). Masson staining of (J) (×100). (L). Hyperplasia of oval cells(single or double rows) from potal area to liver lobes. The nucleus of oval cells was oval, with deep staining and reduced cytoplasm (×600).Figure 1 Histopathological types of bile duct hyperplasia in the aging rats

老齡大鼠膽管增生的病理呈多樣化，可以觀察到膽管細胞增生、增生細胞空泡化、纖維組織增生、膽管上皮細胞肥大、異型、萎縮、消失和肝硬化形成趨勢以及卵圓細胞增生，這些病變被認為是不可逆性改變[1，2，4]。根據(jù)對這些形態(tài)改變的觀察，我們發(fā)現(xiàn)上述病變的多樣化和進展過程，呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，即早期膽管上皮細胞增生，其后發(fā)生膽管周圍纖維組織增生，纖維組織增生又刺激膽管細胞形態(tài)發(fā)生了肥大、化生、萎縮、消失的改變，很多在匯管區(qū)的增生和纖維化病灶逐漸連接起來，形成早期肝硬化的病變趨勢。本文對膽管增生性病變進行了分級觀察，發(fā)現(xiàn)老齡大鼠的膽管增生，多數(shù)處在I級和II級的增生階段，僅少數(shù)病例處于III級的增生階段，這個分級方式與Hailey描述的病變程度大致方向一致[4]，對今后繼續(xù)研究老齡大鼠膽管增生乃至藥物所致的膽管增生不無參考價值。

表2 SD大鼠和Wistar大鼠自發(fā)性膽管增生發(fā)生率比較Table 2 Comparison of spontaneous liver bile duct hyperplasia in the Sprague Dawley rats and Wistar rats

在實驗動物毒性研究中，也有發(fā)現(xiàn)大鼠膽管上皮增生的現(xiàn)象，并認為實驗物質(zhì)的毒性加重上述的病變[1,2,4]。值得提出的是，在大鼠的致癌實驗中，由于應用了強烈的致癌劑或肝毒性因子，如多氯化聯(lián)苯、呋喃、氯仿等也可以引起與大鼠自發(fā)性膽管增生相類似的上述改變或加重增生性病變，但在毒性研究中，膽管的增生往往伴有肝細胞的變性壞死，而老齡大鼠的這些病變不伴有肝細胞損傷，這一點是兩者的重要區(qū)別[5-7]。在毒性實驗工作中，在遇到有些膽管增生病變類似小腸癌病變時，需要和致癌因子引起的膽管腺癌進行鑒別，這些增生的類似小腸腺癌的改變，其實質(zhì)是一種對炎癥和纖維化刺激的適應性的化生[1,4]。

關于卵圓細胞增生，很多文獻認為這些細胞是嚙齒類肝的干細胞，其增生是一種對損傷的修復反應，但在某些致癌實驗中出現(xiàn)卵圓細胞增生，被認為是一種癌前病變[1,2,4,8-10]。我們觀察到卵圓細胞的增生往往與不同類型的膽管增生相伴隨出現(xiàn)，且增生程度也相一致，細胞角蛋白陽性表達。另外，卵圓細胞增生往往出現(xiàn)在肝內(nèi)炎癥病變區(qū)域，說明炎癥和肝細胞損傷可以刺激卵圓細胞的增生，并向膽管上皮或肝細胞方向分化。

關于老齡大鼠膽管增生的病因和發(fā)病機制較為復雜，長期以來沒有明確定論。體內(nèi)外研究報道雌激素有明顯刺激膽管增生的作用，主要是通過活化雌激素受體共活化物St8(steroid-receptor coactivator, Src)、Src 同源蛋白和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)等信號途徑[11-12]。本研究老齡大鼠的雌激素水平應屬于低下狀態(tài)，卻仍然有明顯的膽管增生病例發(fā)生；在另一方面，老齡雄性大鼠的高發(fā)病率，也很難單純用激素水平來解釋，值得進一步研究探討。

總之，膽管增生被看做是一種炎性的、化生性和修復性的反應[4]，其實質(zhì)是作為對膽管損傷的適應性反應，是在多種刺激及損傷因素下產(chǎn)生的。本實驗中發(fā)現(xiàn)的不同種屬、不同性別大鼠的病變差異，除了不能排除激素的影響外，還可能與體內(nèi)的其他具有生物活性的生長因子相關。如有些研究報道，膽酸可刺激體外培養(yǎng)的膽管細胞增生，正常大鼠慢性攝入牛黃膽酸(TCH)和牛黃石膽酸(TLCH)引起血清膽酸積累也可誘導膽管增生，增生的機制是通過表皮生長因子受體介導的途徑誘導膽管細胞增生[13]；還有研究談到炎癥作用和神經(jīng)調(diào)節(jié)作用[14]?？傊?，膽管增生，特別是嚙齒類動物的膽管增生的發(fā)生和發(fā)展受到多種因素的影響和調(diào)控。 本研究使用了較多的動物樣本，較長的飼養(yǎng)周期，細致的病理學觀察，獲得了老齡大鼠膽管增生的可信的實驗結果，可為相關領域的科研及新藥安全評價工作積累豐富的實驗動物的臨床和病理學背景數(shù)據(jù)和資料。

(注：本實驗開始于2010年，實驗周期為2年，2013年進行病理閱片，2014試驗完成。由于實驗涉密問題，于2018年4月完成撰寫投稿)