宋娜，王海軍，李宏彬，邵明龍，張偉，谷騰騰，胡慶，余建，張景航，蘇蔚，趙鐵鎖*，李雨姍*

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院； 2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院； 3. 河南省精神病醫(yī)院，河南省生物精神病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院； 4. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；河南新鄉(xiāng) 453003)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種慢性、進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)障礙疾病，是繼阿爾茨海默氏癥后第二常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。據(jù)估計(jì)，全球范圍內(nèi)50歲以上的人群每1萬人就有570人患有此病，并且該比例隨年齡增加而增加[1]。運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直、靜止性震顫、姿勢步態(tài)障礙等都是PD的典型特征。此外，PD也會引起非運(yùn)動(dòng)特征的改變，嚴(yán)重影響了PD患者的生活質(zhì)量[2]。臨床病理表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)-致密部多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失，神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)有路易小體(lewy body，LB)的形成。黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性與帕金森病運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)相關(guān)，其他外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域參與PD非運(yùn)動(dòng)特征的改變[3-5]。

PD患者以散發(fā)病例為主，隨著家族性PD致病基因α-SYN、UCHL1、LRRK2、Parkin、PINK1和DJ-1等基因的發(fā)現(xiàn)，人們認(rèn)為環(huán)境和遺傳因素共同作用導(dǎo)致PD的發(fā)生[6-8]。α-SYN基因編碼突觸核蛋白，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與PD發(fā)病有關(guān)的基因，該基因的A30P、A53T、E46 K以及G51D點(diǎn)突變均與PD的發(fā)病相關(guān)[9-13]。α-SYN基因突變導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)改變，形成蛋白聚積[14-15]。異常的α-SYN蛋白聚積與Lewy小體的形成，多巴胺能神經(jīng)元的死亡乃至PD發(fā)生有密切的關(guān)系，研究人員認(rèn)為α-SYN聚集是導(dǎo)致散發(fā)性PD發(fā)生發(fā)展的一個(gè)中心環(huán)節(jié)。

α-SYN的A30P和A53T突變是家族遺傳性PD發(fā)生的主要原因[16-17]，而α-SYNA30P突變體可以產(chǎn)生與散發(fā)性PD類似的癥狀，因此研究者們認(rèn)為α-SYN是把PD的遺傳因素和環(huán)境因素結(jié)合起來的紐帶。在本研究中，我們構(gòu)建了α-SYNA30P慢病毒突變體載體，體外轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，包裝并濃縮病毒液。利用立體定位單側(cè)注射技術(shù)將過表達(dá)α-SYNA30P的病毒注射到大鼠黑質(zhì)致密部，建立了α-SYNA30P 轉(zhuǎn)基因大鼠模型，通過免疫熒光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在α-SYNA30P過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因大鼠中，表現(xiàn)出中腦黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元大量變性丟失的病理改變，為體外模型的建立及帕金森等神經(jīng)退行性疾病的研究及治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級Wistar雌性大鼠，2月齡，體重180～200 g。購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】，飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院【SYXK(豫)2014-0005】。所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞系293FT、pLKO-GFP質(zhì)粒、pMD2.G質(zhì)粒、psPAX2質(zhì)粒(北京生命科學(xué)研究所轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中心饋贈)，α-synclein mAb(15G7，ALX-804-258)購于Enzo公司(美國)，酪氨酸羥化酶抗體(tyrosine hydroxylase，TH，Ab152)購于Millipore公司(美國)，Alexa Fluor 488/555熒光二抗購于Life公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒過表達(dá)野生型和突變型α-SYN載體的構(gòu)建和鑒定

(1)pLKO-CMV-α-SYN-WT-P2A-GFP載體構(gòu)建

以人α-SYN基因 cDNA質(zhì)粒(Thermo Fisher公司，NM_000345.3)為模版，PCR擴(kuò)增α-SYN-WT-P2A片段。在上下游引物5’端分別引入HindIII，Xhol酶切位點(diǎn)及P2A片段。通過PCR擴(kuò)增獲得α-SYN-WT-P2A片段，與pcDNA3.1(+) myc-HisB載體連接構(gòu)建pcDNA3.1(+) myc-HisB-α-SYN-WT-P2A重組載體；以重組載體pcDNA3.1(+) myc-HisB-α-SYN-WT-P2A為模板進(jìn)行PCR，獲得CMV-α-SYN-WT-P2A片段，在上下游引物5’端分別引入SacII，BamHI酶切位點(diǎn)(引物序列見表1)。SacII與BamHI雙酶切獲得CMV-α-SYN-WT-P2A片段，與pLKO-GFP載體連接，最終獲得pLKO-CMV-α-SYN-WT-P2A-GFP基因表達(dá)載體。

(2)pLKO-CMV-α-SYN-A30P-P2A-GFP載體構(gòu)建

以pLKO-CMV-α-SYN-WT-P2A-GFP為模版，在A30P所在的位置進(jìn)行定點(diǎn)突變(引物序列見表1)，將獲得的PCR混合物經(jīng)Dpn1內(nèi)切酶消化，經(jīng)轉(zhuǎn)化連接形成pLKO-CMV-α-SYN-A30P-P2A-GFP基因表達(dá)載體。

1.2.2 Western blot 檢測α-SYN的表達(dá)

蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入TBST稀釋的大鼠抗人α-SYN抗體，4℃過夜，TBST洗膜三次，加入山羊抗大鼠IgG，室溫1 h，ECL發(fā)光液顯影檢測。

1.2.3 慢病毒的包裝、濃縮和滴度測定

5×106293FT細(xì)胞接種于15 cm的培養(yǎng)皿中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80% ～90%時(shí)，使用PEI進(jìn)行轉(zhuǎn)染質(zhì)?；旌衔?慢病毒基因載體質(zhì)粒、pMD2.G質(zhì)粒和psPAX2質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染48 h，吸取上清，并繼續(xù)加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，72 h后吸取上清。吸取的上清用0.45 μm濾膜過濾后濃縮。4℃ 45 000 r/min離心1.5 h，濃縮的病毒液-80℃凍存。將1 μL 濃縮后的病毒加到2 mL的培養(yǎng)基中稀釋，分別加10，20，40，100 μL稀釋液到細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基總體積1 mL。每孔加入終濃度5 μg/mL polybrene，6孔板25℃ 1800 r/min離心1 h進(jìn)行侵染，72 h流式測定病毒滴度。

1.2.4 大鼠腦立體定位注射慢病毒顆粒

將2月齡，體重約200 g 的Wistar成年大鼠固定于立體定位儀上，異氟烷麻醉。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的大鼠腦立體定位圖譜確定黑質(zhì)(substantia nigra，SN)兩個(gè)注射位點(diǎn)[18]，分別注射2 μL慢病毒，按0.2 μL/min的速度推進(jìn)。

1.2.5 冰凍切片的制備及觀察

術(shù)后21 d，用10%阿佛丁麻醉劑(1 mL/ 200 g體重)對大鼠腹腔注射進(jìn)行麻醉。用穿刺針經(jīng)左心室刺入主動(dòng)脈灌注0.9%生理鹽水沖洗至肝變白，再用4%多聚甲醛固定斷頭取腦組織。經(jīng)4%多聚甲醛固定后放入30%的蔗糖溶液中， OCT包埋，冰凍切片厚度為40 μm。切片經(jīng)甲醇處理后，PBST洗滌3次，微波爐法進(jìn)行抗原修復(fù)，10%驢血清封閉1 h，加入一抗，4℃過夜。PBST洗滌3次，加入熒光二抗，37℃ 1 h，PBST洗滌3次， DAPI染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6 Rotating rod 實(shí)驗(yàn)

大鼠分為注射慢病毒稀釋液組、α-SYNWT和α-SYNA30P三組，每組4只，雌雄各半。每只大鼠實(shí)驗(yàn)前訓(xùn)練5 min，使其能夠在轉(zhuǎn)棒儀上停留，隨后休息20 min，轉(zhuǎn)速為20 r/min。以180 s作為實(shí)驗(yàn)終止時(shí)間。每只大鼠測試3次，取平均值。結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，P< 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人α-SYN基因的慢病毒重組載體的構(gòu)建

以特異性引物PCR擴(kuò)增人α-SYN基因片段，經(jīng)電泳檢測可見約506 bp特異性條帶(圖1A)。按照方法1.2.1進(jìn)行載體構(gòu)建，測序結(jié)果顯示無突變，表明pLKO-CMV-α-SYN-WT-P2A-GFP和pLKO-CMV- α-SYN -A30P-P2A-GFP載體構(gòu)建成功(圖1B)。將載體分別轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，24 h后，Western blot檢測人源α-SYN的表達(dá)，結(jié)果顯示293FT-WT和293FT-A30P細(xì)胞在18 KD處蛋白表達(dá)明顯高于對照組，表明構(gòu)建的野生型和突變型A30P表達(dá)載體都能夠過表達(dá)α-SYN蛋白(圖1C)。

2.2 病毒滴度的測定

將1 μL濃縮的病毒顆粒稀釋2000倍，從2 mL稀釋液中分別取10，20，40，100 μL侵染細(xì)胞，根據(jù)4個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)得到病毒滴度的線性關(guān)系y=1.4785x+0.0054(圖2A)。之后用1 μL濃縮的病毒顆粒感染293FT細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可觀察到較強(qiáng)的綠色熒光，表明病毒可以有效侵染細(xì)胞(圖2B)。

注：A.人α-SYN基因片段的PCR檢測。 M，DL2000 DNA marker；泳道1為擴(kuò)增得到的片段。 B.pLKO-α-SYN-P2A-GFP表達(dá)載體的構(gòu)建 C.免疫印跡檢測細(xì)胞內(nèi)α-SYN蛋白的表達(dá)。GAPDH為內(nèi)參，Ctrl：pLKO-GFP空質(zhì)粒，hWT：人野生型pLKO-α-SYN-WT-P2A-GFP表達(dá)載體，A30P：突變型pLKO-α-SYN - A30P -P2A-GFP表達(dá)載體。圖1 人α-SYN基因慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定Note. A. Amplification of the human α-synuclein determined by PCR. M: DL2000 DNA marker. Lane 1: amplified human α-SYN gene. B. Construction of the pLKO-α-SYN-P2A-GFP vector. C. Expression levels of α-SYN protein in 293FT cells detected by western blot. GAPDH was used as a loading control. hWT, Wild type α-SYN expression vector. A30P, α-SYN-A30P mutation expression vector.Figure 1 Construction and identification of a lentivirus-mediated human α-SYN gene expression vector

注：A. 病毒滴度曲線；B. 病毒濃縮液感染293FT細(xì)胞48 h后熒光檢測結(jié)果。圖2 病毒滴度的測定Note. A. Virus titer curve. B. Fluorescence detection of 293FT cells at 48 h post-infection.Figure 2 Determining the virus titer

2.3 注射過表達(dá)慢病毒α-SYN A30P導(dǎo)致中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶神經(jīng)元缺失

取慢病毒α-SYNA30P注射大鼠組織切片，酪氨酸羥化酶免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，與對照相比，注射α-SYNWT和α-SYNA30P組的中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶陽性信號明顯減少，說明多巴胺神經(jīng)元數(shù)量大量減少。另外注射α-SYNWT組與α-SYNA30P組相比，α-SYNA30P慢病毒注射組導(dǎo)致中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)量顯著缺失(圖3 A)。對注射組α-SYNA30P腦組織切片進(jìn)行免疫熒光，結(jié)果顯示注射慢病毒α-SYNA30P的中腦黑質(zhì)致密部出現(xiàn)α-SYN陽性著色(紅色熒光區(qū)域)，提示α-SYN在此區(qū)域的大量聚集，而對應(yīng)的該區(qū)域酪氨酸羥化酶染色幾乎呈陰性，表明多巴胺能神經(jīng)元缺失，可能發(fā)生了變性壞死的現(xiàn)象(圖3B)。根據(jù)該結(jié)果，我們可以判定α-SYNA30P突變促進(jìn)了α-SYN蛋白的聚集和沉積。

2.4 Rotating rod 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步證實(shí)注射α-SYNA30P慢病毒對大鼠行為的影響，我們選取2月齡大鼠注射慢病毒，三周之后進(jìn)行rotating rod實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)注射慢病毒稀釋液組的大鼠沒有出現(xiàn)行為改變，在轉(zhuǎn)棒儀上停留平均時(shí)間為165 s，而注射hWT和A30P組均出現(xiàn)協(xié)調(diào)能力下降，在轉(zhuǎn)棒儀上停留的時(shí)間均短于注射慢病毒稀釋液組，注射hWT組大鼠的停留平均時(shí)間為125 s，注射α-SYNA30P組大鼠的停留平均時(shí)間為102 s，注射hWT和A30P組較注射慢病毒稀釋液組統(tǒng)計(jì)結(jié)果均為P< 0.05。見圖4。

圖4 注射過表達(dá)慢病毒α-SYN A30P大鼠rotating rod實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 4 Rotating rod performance in the lentiviral-mediated α-SYN A30P group

3 討論

PD是威脅老年人群健康的重要疾病[19]，模型的構(gòu)建是研究該疾病的關(guān)鍵工具。目前PD模型主要有動(dòng)物和細(xì)胞兩大類，動(dòng)物模型作為獨(dú)立的有機(jī)個(gè)體，相對于細(xì)胞模型能更好的模擬體內(nèi)PD發(fā)病過程，便于直觀觀測PD的臨床病癥，利于研究者發(fā)現(xiàn)PD新療法[20-23]。運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是研究PD發(fā)病機(jī)制的重要途徑，慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)以其高效的侵染效率在分子生物領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[24]。 本研究中，我們利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建了過表達(dá)野生型α-SYN以及突變型α-SYNA30P載體，并通過立體定位技術(shù)對大鼠腦部黑質(zhì)致密部注射慢病毒顆粒制備α-SYN轉(zhuǎn)基因大鼠。

α-SYN在哺乳動(dòng)物和人類的腦內(nèi)含量豐富，主要存在于神經(jīng)元的突觸前末端，在海馬、皮質(zhì)、杏仁和嗅球等突觸豐富的區(qū)域廣泛分布[25]。正常的α-SYN起調(diào)節(jié)突觸囊泡內(nèi)環(huán)境和神經(jīng)傳遞的作用，但異常的α-SYN蛋白則聚集成絲狀并最終形成小體[14-15]。α-SYN可通過其自身的過表達(dá)、突變、分子結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤折疊、原纖維及纖維形成參與多巴胺能神經(jīng)元的損傷過程產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，同時(shí)該基因的改變會激發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷線粒體功能等多個(gè)方面影響PD發(fā)病[3, 26-34]。

本研究將慢病毒注射大鼠腦部黑質(zhì)致密部，雖未觀察到典型的路易小體形成，但免疫熒光結(jié)果顯示野生型和突變體兩組轉(zhuǎn)基因大鼠中腦黑質(zhì)致密部神經(jīng)元大量丟失。與野生型α-SYN注射組相比，注射突變體病毒顆粒導(dǎo)致中腦黑質(zhì)致密部神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。過表達(dá)α-SYNA30P組織切片的免疫熒光雙染結(jié)果顯示，中腦黑質(zhì)致密部紅色熒光強(qiáng)度高，表明α-SYN在該區(qū)域表達(dá)量高，在神經(jīng)元缺失區(qū)域內(nèi)的大量聚集，提示α-SYNA30P突變促進(jìn)α-SYN蛋白的聚集和沉積。另外在該聚積部位多巴胺合成的限速酶TH幾乎不表達(dá)，進(jìn)一步證明黑質(zhì)神經(jīng)元在此部位的丟失變性。這些結(jié)果提示我們制備的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物較好的模擬了PD病人的重要病理特征。此外，本研究中的rotating rod實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)α-SYNA30P大鼠與對照組相比均表現(xiàn)為協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)能力下降。總之，本研究建立的α-SYNA30P帕金森大鼠可以模擬PD患者的一部分典型運(yùn)動(dòng)障礙特征。

α-SYN在家族遺傳性和散發(fā)性PD中均扮演著重要的角色，構(gòu)建α-SYN轉(zhuǎn)基因大鼠可以幫助研究人員更好的認(rèn)識帕金森疾病，明確該疾病的發(fā)病機(jī)制。我們構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因大鼠可以較好的表現(xiàn)出PD疾病的主要病理特征，為進(jìn)一步研究帕金森疾病發(fā)生發(fā)展、靶點(diǎn)藥物開發(fā)及治療提供工具。