魯香鳳，張書信，傅麗元，戴欣，孫浩

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院； 2. 病理科； 3. 肛腸科，北京 100700)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種主要累及直腸、結(jié)腸黏膜、黏膜下層的慢性非特異性腸道炎癥和潰瘍性疾病，常伴不典型增生，部分可發(fā)生癌變，一般認(rèn)為與感染、食物因素、免疫缺陷、分泌的粘液異常、基因缺陷和心理不正常等因素有關(guān)[1-2]，是現(xiàn)代難治病。

國(guó)內(nèi)外多位學(xué)者研究均認(rèn)為葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)復(fù)制UC模型是最近似人UC的模型[3-6]，但與人UC之間的區(qū)別與聯(lián)系尚未見報(bào)道。為進(jìn)一步研究UC發(fā)病機(jī)制及中藥療效機(jī)制，我們采用DSS復(fù)制大鼠UC模型，并觀察張書信治療UC有效方劑[7]的預(yù)防治療作用，發(fā)現(xiàn)療效不佳，為探討其原因，將DSS復(fù)制大鼠UC模型與人UC進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)二者在病因、早期大腸黏膜病變、脈管病變及血栓形成、隱窩腔內(nèi)容物、黏膜潰瘍形成過(guò)程及機(jī)制、間質(zhì)漿細(xì)胞數(shù)量、隱窩干細(xì)胞損傷的時(shí)期及程度、中醫(yī)證型等方面均有所不同，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠20只，體重(200±20)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0011】，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室屏障環(huán)境動(dòng)物室【SYXK(京)2015-0001】。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào):17-21)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DSS相對(duì)分子量為(36～50)×103，購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司；大便潛血試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；3.5%水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水酒精(北京貞玉民生藥業(yè)有限公司)；4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

5 ml注射器；剪刀；鉗子；玻璃平皿；玻璃燒杯等；全自動(dòng)脫水機(jī)(Thermo Excelsior AS，德國(guó))；石蠟切片機(jī)(HM325型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，德國(guó))；光學(xué)顯微鏡(AX1O Lab.A1，德國(guó))；圖像采集系統(tǒng)(RPT-PathQC，中國(guó))。

1.1.4 臨床材料

選取北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院診治的人UC 9例，其中1例為部分腸管切除，8例為結(jié)腸鏡活檢。

1.2 方法

1.2.1 5% DSS配制及造模方法[8]

將DSS以5%質(zhì)量體積比(w/v)溶解于去離子水中，每日現(xiàn)用現(xiàn)配。20只大鼠分為正常組和模型組各10只，模型組大鼠自由飲用5% DSS 10 d，正常組飲用去離子水10 d。

1.2.2 動(dòng)物觀察方法

觀察大鼠毛澤、活動(dòng)、食量、大便性狀及肛門局部情況等，并測(cè)量大鼠體重及大便潛血(鄰聯(lián)甲苯胺法)等。

1.2.3 標(biāo)本取材、組織處理及染色方法

實(shí)驗(yàn)到期后，大鼠禁食不禁水12 h，抽血后取全部大腸并量取長(zhǎng)度，用9%生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物。人UC 8例為結(jié)腸鏡下取黏膜病變區(qū)活檢2～3塊，1例為手術(shù)切除部分腸管。

所有標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片(厚度約4～5 μm)，HE染色。

1.2.4 病理學(xué)觀察方法

大體觀察：腸壁厚度、外膜病變、大腸黏膜糜爛潰瘍及結(jié)節(jié)等。

光鏡觀察：大腸黏膜炎癥、隱窩膿腫及結(jié)構(gòu)、糜爛潰瘍等。

2 結(jié)果

2.1 大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 一般狀況

注：A.早期病變始于大腸黏膜固有層下1/3隱窩消失，其周圍隱窩擴(kuò)張。B.大腸黏膜中下2/3層隱窩消失，其旁部分隱窩擴(kuò)張，少數(shù)隱窩腔內(nèi)以巨噬細(xì)胞為主。C.大腸黏膜全層隱窩消失，偶見隱窩膿腫，部分表面上皮呈絨毛狀。D.大腸黏膜全層隱窩消失，部分表面上皮變性壞死并脫落，炎癥較輕。 E.大腸黏膜糜爛潰瘍，固有膜多個(gè)血管腔內(nèi)可見血栓形成。F.大腸黏膜潰瘍深及黏膜下層伴出血，黏膜下多個(gè)血管腔內(nèi)可見血栓形成。圖1 DSS模型組大腸黏膜病理變化(HE染色，A、B、C、D、F ×200；E×100)Note. (A) Early lesions begin with the disappearance of the lower 1/3 of crypts in the lamina propria in the large intestine, with dilatation of the surrounding crypts. (B) The crypts in the lower 2/3 layer of the large intestine disappear, and the adjacent partial crypts expand. Macrophages are mainly observed in the cavities of a few crypts. (C) The full layer crypts of the large intestine disappear, with occasional crypt abscesses and villous surface epithelia. (D) The full-thickness crypts of the large intestine disappear, and the partial surface epithelium become necrotic, with reduced inflammation. (E) Mucosal erosion and ulceration of the large intestine, with thrombosis in the majority of blood vessels in the lamina propria. (F) Ulcer of the colorectal mucosa and submucosa, with hemorrhage and thrombosis in numerous vessels in the submucosa. (HE staining).Figure 1 Colorectal mucosal lesions in dextran sulfate sodium (DSS) model group(HE staining. A, B, C, D, F ×200. E×100)

正常組：大鼠活動(dòng)、食量及二便均正常，毛發(fā)光澤，糞便質(zhì)地較硬，暗褐色，呈橢球形，體重增長(zhǎng)較快。

DSS模型組：造模第3天，動(dòng)物活動(dòng)減少，反應(yīng)遲緩，毛發(fā)欠光澤；第4天5只出現(xiàn)軟便，2只狂躁；第5天部分動(dòng)物出現(xiàn)粘液便，肛周污穢，個(gè)別反應(yīng)遲鈍；第6天部分反應(yīng)遲鈍；第7天部分動(dòng)物肛門潮濕，個(gè)別大便伴點(diǎn)狀出血；第9天部分動(dòng)物潛血(+)或肉眼血便，個(gè)別大便變細(xì)，體重下降。

2.1.2 大體觀察

正常組：大腸總長(zhǎng)度約12.5～23 cm，黏膜淡紅、光滑完整，皺襞清晰，無(wú)出血點(diǎn)。

DSS模型組：大腸總長(zhǎng)度約8.5～20 cm，部分腸壁增厚，黏膜可見多個(gè)大小不等潰瘍，針尖樣或不規(guī)則形，切面灰白色，質(zhì)中，部分黏膜皺襞變平，部分近肛門處黏膜呈結(jié)節(jié)狀隆起，病變以直腸和左半結(jié)腸為主。

2.1.3 光鏡觀察

(1)正常組：大腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊緊密，隱窩結(jié)構(gòu)正常，杯狀細(xì)胞多，偶見或少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

(2)DSS模型組：多數(shù)動(dòng)物大腸黏膜早期病變始于固有膜下1/3隱窩萎縮消失(圖1 A)，其旁可見隱窩膿腫伴/不伴隱窩擴(kuò)張(圖1B),逐漸向中表層及周圍擴(kuò)展，直至全層隱窩萎縮消失，部分隱窩腔內(nèi)為單核巨噬細(xì)胞，局部表面上皮呈絨毛狀(圖1C)，僅少數(shù)病例始于中上1/3隱窩，隱窩消失區(qū)炎癥較輕，早期僅見單核巨噬細(xì)胞，未見或極少漿細(xì)胞，然后表面上皮出現(xiàn)變性壞死并脫落(圖1D)，隨之黏膜糜爛潰瘍形成，常伴出血，固有膜間質(zhì)纖維母細(xì)胞增生，與表面垂直(圖1E)，固有膜及黏膜下層可見多個(gè)血管內(nèi)纖維素血栓形成,偶見血栓伴機(jī)化，隨著病變進(jìn)展，潰瘍表面纖維素及中性粒細(xì)胞滲出由少到多，并見細(xì)菌及霉菌(圖1F)，部分病例潰瘍廣泛，深達(dá)黏膜下層；1只黏膜下小血管壁伴纖維素樣壞死；多數(shù)病例淋巴小結(jié)上方可見黏膜潰瘍，間質(zhì)炎癥主要累及黏膜和黏膜下層，少數(shù)累及全層，局部上皮呈輕度不典型性，未見癌變；部分黏膜下層因高度水腫伴或不伴出血而顯著增寬；部分黏膜下及漿膜面纖維化，1只腸壁固有肌層局灶纖維化；局部擴(kuò)張的淋巴管內(nèi)可見淋巴細(xì)胞淤積，近肛側(cè)端黏膜及黏膜下層可見淋巴組織增生、淋巴小結(jié)及集合淋巴小結(jié)形成。

注： A.早期中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)表面上皮和淺層黏膜隱窩。 B.隱窩膿腫破壞隱窩形成隱窩潰瘍。C.大腸黏膜急性期潰瘍。D.大腸黏膜潰瘍處血管內(nèi)偶見微血栓形成。圖2 人UC大腸黏膜病理變化(HE染色, ×200)Note.(A) Early infiltration of neutrophils the surface epithelia and superficial mucosa crypts. (B) The crypt abscess destroys the crypts and forms crypt ulcers. (C) Acute stage ulcers of the colorectal mucosa. (D) Formation of microthrombi in the blood vessels of the UC of the large intestine.Figure 2 Colorectal mucosal lesions in human ulcerative colitis (UC)(HE staining, ×200)

2.2 臨床病例觀察結(jié)果

2.2.1 臨床資料

共9例，其中男性4例，年齡自35-77歲，平均63.5歲；女性5例，年齡自31～61歲，平均43.8歲；8例為腸鏡活檢，1例(男性，73歲)為手術(shù)切除部分腸管。

2.2.2 大體所見

1例為橫結(jié)腸及降結(jié)腸腸管一段，長(zhǎng)約23.5 cm，大腸黏膜呈天鵝絨狀，病變連續(xù)，可見多個(gè)大小不等的潰瘍，最大者直徑約0.8 cm，最小者針尖大，潰瘍底平坦，邊緣隆起，切面灰白色，質(zhì)韌脆，部分區(qū)呈息肉樣；其余8例活檢均為粟粒大灰白色軟組織。

2.2.3 光鏡所見

均見大腸黏膜慢性炎、隱窩炎(圖2 A)、隱窩膿腫(圖2B)、隱窩結(jié)構(gòu)紊亂及萎縮、糜爛潰瘍(圖2C)及腺體輕度不典型增生等，8例活檢組織均未見血栓；腸管切除病例急性期和消散期病變共存，固有膜偶見血管內(nèi)微血栓，未見機(jī)化(圖2D)，局部固有肌層內(nèi)血管內(nèi)膜明顯增厚，可見血栓形成并機(jī)化，潰瘍旁可見炎性息肉和/或腺瘤形成，局部隱窩萎縮區(qū)炎癥不明顯；消散期中性粒細(xì)胞減少，特別是隱窩膿腫減少，乃至消失，局部表面上皮再生，隱窩分支不規(guī)則，甚至短縮，其基底部與黏膜肌的距離增加，漿細(xì)胞增多；局部可見異型增生腺體浸及黏膜下層，局部肌層可見血管脂肪纖維組織增生，黏膜下及漿膜面可見纖維化，局部伴結(jié)腸黑變病，固有肌層及漿膜面均可見陳舊性出血；局部淋巴管擴(kuò)張，但未見淋巴細(xì)胞淤積，局部伴淋巴小結(jié)及集合淋巴小結(jié)形成。

3 討論

DSS復(fù)制大鼠UC模型與人UC有如下異同之處：

3.1 臨床表現(xiàn)

人UC病程長(zhǎng)，臨床表現(xiàn)為便血、痙攣性腹痛和腹瀉等，常伴營(yíng)養(yǎng)缺乏和貧血等；DSS模型病程短，有粘液便、大便帶血或血便，體重不同程度減輕等。

3.2 大腸黏膜組織病理學(xué)變化

二者均存在隱窩干細(xì)胞損傷，不同之處有：①早期大腸黏膜病變及潰瘍形成過(guò)程：多數(shù)DSS模型早期病變始于固有膜增殖區(qū)隱窩萎縮消失；而人UC早期病變始于表面上皮及淺層隱窩急性炎，典型病變?yōu)樵鲋硡^(qū)的隱窩炎和隱窩膿腫[9],隱窩膿腫一方面把膿液排入腸腔，另一方面向固有膜和黏膜下層破潰，炎癥遂向縱深擴(kuò)散，使該處組織壞死形成潰瘍[1]。②脈管病變、部位及程度：DSS模型固有膜及黏膜下層較多小血管內(nèi)可見血栓形成，局部淋巴管內(nèi)淋巴細(xì)胞淤積；而人UC固有膜及固有肌層內(nèi)均偶見血栓，局部血管內(nèi)膜明顯增厚，淋巴管內(nèi)未見淋巴細(xì)胞淤積。③隱窩腔內(nèi)容物：人UC隱窩腔內(nèi)均以中性粒細(xì)胞為主，而DSS模型少部分隱窩腔內(nèi)以單核巨噬細(xì)胞為主，類似人克羅恩病(Crohn’s disease，CD)的改變。④病期及間質(zhì)漿細(xì)胞數(shù)量：DSS模型均屬急性期，漿細(xì)胞缺乏或極少，而人UC病例均存在大腸黏膜慢性炎的基礎(chǔ)病變，漿細(xì)胞較多；Finkelstein等[9]認(rèn)為間質(zhì)漿細(xì)胞少是早期CD的特征之一。⑤腺體不典型增生發(fā)生率：DSS模型明顯較低，而人UC發(fā)生率為100%，手術(shù)切除病例尚伴炎性息肉及腺瘤形成。

3.3 病因

DSS模型的病因是單一因素，相當(dāng)于人體腸道內(nèi)含有毒有害物質(zhì)的內(nèi)容物；而人UC的誘因尚有精神刺激、飲食、過(guò)度勞累及感染等。

3.4 發(fā)病機(jī)制

3.4.1 相似機(jī)制

①細(xì)胞毒作用：DSS和人體腸道內(nèi)含有毒有害物質(zhì)的內(nèi)容物，均可直接損傷大腸上皮細(xì)胞,不需要T或B細(xì)胞的存在[4，10]；人UC中存在著腸上皮緊密聯(lián)接的破壞[11]，DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸緊密連接蛋白和緊密連接相關(guān)蛋白-1表達(dá)下降[12]。②血管損傷、外周血高凝狀態(tài)及微循環(huán)缺血缺氧等[13-14]：張宸豪等[15]體外研究發(fā)現(xiàn)DSS可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，內(nèi)膜粗糙，血小板粘附，繼而纖維素血栓形成，血液循環(huán)不暢，血供不足，隱窩上皮因缺血缺氧而變平萎縮，甚至消失，使腸黏膜通透性增大，病原體進(jìn)入腸黏膜固有層后誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活，通過(guò)氧依賴性和氧非依賴性機(jī)制發(fā)揮殺菌和細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致靶細(xì)胞破壞，并產(chǎn)生抗體、補(bǔ)體和免疫復(fù)合物等，沉積于腸道微循環(huán)，造成血管損傷。③細(xì)菌感染及/或腸道微生態(tài)顯著失衡[16-18]。④隱窩阻塞：可直接損害隱窩細(xì)胞[19]。⑤免疫機(jī)制；⑥致癌作用：DSS和人體腸道內(nèi)容物均可直接或間接刺激腸黏膜引起炎癥[20]，日久可發(fā)生癌變[21]。

3.4.2 不同機(jī)制

①DSS首先損傷血管，致使增殖區(qū)隱窩干細(xì)胞萎縮消失，不能產(chǎn)生新細(xì)胞并向黏膜表面移行、分化和成熟，導(dǎo)致全層隱窩消失，繼而上皮破壞脫落，黏膜潰瘍形成；另外，巨噬細(xì)胞數(shù)量增多并吸收DSS后釋放溶酶體酶，也可直接損害隱窩細(xì)胞[19]；而人UC病變始于大腸黏膜細(xì)菌感染,因患者機(jī)體免疫功能低下或異常、腸道屏障防御機(jī)制薄弱不能及時(shí)將之清除，或使腸道正常菌群結(jié)構(gòu)和功能破壞，導(dǎo)致血管損傷，繼發(fā)隱窩干細(xì)胞受損。②人UC血管損傷程度較DSS模型輕,故人UC典型病變較DSS模型出現(xiàn)慢，但DSS復(fù)制大鼠UC急性期模型在停用DSS數(shù)天后病變可逐漸恢復(fù)，而人UC則病程較長(zhǎng)久，很難自愈。

綜上所述，二者大腸黏膜組織病理學(xué)變化及發(fā)病機(jī)制均有異同，DSS首先損傷血管致使隱窩干細(xì)胞受損萎縮，炎癥是繼發(fā)病變，而人UC則相反，隱窩干細(xì)胞損傷是二者的共同點(diǎn)，也是UC的本質(zhì)，“治病必求其本”，故治療的重點(diǎn)應(yīng)該是修復(fù)受損隱窩干細(xì)胞功能，阻止或保護(hù)干細(xì)胞不再受損，促進(jìn)其存活和分化。按照中醫(yī)辨證論治原則，藥證相符的中藥才有效，對(duì)人UC某種證型有效的方劑對(duì)DSS模型療效不明顯應(yīng)是中醫(yī)證型不相符及/或發(fā)病機(jī)制不同所致。關(guān)于DSS模型的中醫(yī)證型探討以后再做詳細(xì)報(bào)道，采用該模型研究臨床有效藥物療效及其機(jī)制需辨證分析其結(jié)果。