梁藝懷，張京佶，張琨，王綠平，殷浩文

(上海市檢測(cè)中心 生物與安全檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203)

在化學(xué)品生態(tài)毒性試驗(yàn)體系中，魚(yú)類(lèi)作為水生生態(tài)毒性試驗(yàn)體系中的頂級(jí)脊椎動(dòng)物，具有不可替代的地位。因此，早在化學(xué)品安全管理體系建立之初，發(fā)達(dá)國(guó)家就通過(guò)大量標(biāo)準(zhǔn)化研究推出了具有科學(xué)基礎(chǔ)、符合管理要求的代表性試驗(yàn)魚(yú)種。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)在20世紀(jì)80年代即推薦斑馬魚(yú)(Daniorerio)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)、藍(lán)鰓魚(yú)(Lepomismacrochirus)和青鳉(Oryziaslatipes)等魚(yú)種作為為毒性試驗(yàn)材料魚(yú)。在經(jīng)濟(jì)全球化的時(shí)代，化學(xué)品安全管理早已突破地域的限制，發(fā)達(dá)國(guó)家將管理體系和標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)的優(yōu)勢(shì)擴(kuò)大到化學(xué)品的整個(gè)生命周期，延伸到貿(mào)易活動(dòng)的各個(gè)層面。

試驗(yàn)生物的選擇需要考慮區(qū)域生態(tài)相關(guān)性。中國(guó)是一個(gè)幅員遼闊、生態(tài)系統(tǒng)類(lèi)型完整的國(guó)家，在物種標(biāo)準(zhǔn)化過(guò)程中不應(yīng)該忽視生態(tài)特殊性和脆弱性。在中國(guó)的化學(xué)品環(huán)境管理中，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化研究推出中國(guó)特有的受試生物，既能精準(zhǔn)保護(hù)我國(guó)的生態(tài)環(huán)境安全，又可對(duì)歐美發(fā)達(dá)國(guó)家主導(dǎo)的化學(xué)品測(cè)試體系進(jìn)行補(bǔ)充。稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)是我國(guó)特有的一種小型鯉科魚(yú)類(lèi)，已實(shí)現(xiàn)常年實(shí)驗(yàn)室人工繁殖[1]。因其生物學(xué)特征研究已較為系統(tǒng)，國(guó)內(nèi)許多科研單位、測(cè)試機(jī)構(gòu)使用稀有鮈鯽開(kāi)展生命科學(xué)研究或生態(tài)毒性檢測(cè)[2-4]。

稀有鮈鯽是我國(guó)化學(xué)品魚(yú)類(lèi)測(cè)試方法標(biāo)準(zhǔn)化的首選魚(yú)種。在完成稀有鮈鯽急性毒性試驗(yàn)適用性驗(yàn)證工作[5]后，首個(gè)以稀有鮈鯽為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)生物的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 29763-2013化學(xué)品 稀有鮈鯽急性毒性試驗(yàn)》[6]已經(jīng)頒布實(shí)施。然而，急性毒性試驗(yàn)只是諸多魚(yú)類(lèi)試驗(yàn)中的一項(xiàng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足化學(xué)品的危害評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的數(shù)據(jù)要求。實(shí)驗(yàn)生物在承受長(zhǎng)時(shí)間、低劑量的受試物質(zhì)暴露時(shí)，所處生命周期的階段不同，毒性效應(yīng)的發(fā)生機(jī)制和出現(xiàn)時(shí)間都可能存在很大差異，比單純的急性毒性試驗(yàn)?zāi)軌蛱峁└嘤袃r(jià)值的數(shù)據(jù)信息。在開(kāi)展化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，慢性毒性數(shù)據(jù)種間外推的不確定性和評(píng)估因子較小，能夠優(yōu)化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的結(jié)論。因此，對(duì)于我國(guó)特有實(shí)驗(yàn)魚(yú)種用于化學(xué)品生態(tài)毒性測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)化戰(zhàn)略，將稀有鮈鯽的毒性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)從急性毒性延長(zhǎng)到慢性毒性、從單一的死亡終點(diǎn)擴(kuò)展到發(fā)育、生殖等更多的效應(yīng)終點(diǎn)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[7]。

本研究旨在驗(yàn)證稀有鮈鯽對(duì)魚(yú)類(lèi)幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)的適用性，為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制項(xiàng)目《化學(xué)品稀有鮈鯽幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)》(20140324-T-469)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究中各實(shí)驗(yàn)室所使用的動(dòng)物源自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所構(gòu)建的稀有鮈鯽IHB系(野生型封閉群)或引種后自行繁育， SPF級(jí)。單次試驗(yàn)所用幼魚(yú)均為同一批次，初始魚(yú)齡2～3個(gè)月，初始體重0.05～0.10 g。在試驗(yàn)開(kāi)始前，幼魚(yú)在試驗(yàn)條件下至少馴養(yǎng)兩周。

1.1.2 參比物質(zhì)

重鉻酸鉀(potassium dichromate，K2Cr2O7，GR，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20140708)，是水生毒性試驗(yàn)中常用的無(wú)機(jī)參比物質(zhì)。其性質(zhì)穩(wěn)定，試驗(yàn)結(jié)果可靠，可比性強(qiáng)。

3,4-二氯苯胺(3,4-dichloroaniline，C6H5Cl2N，98%，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)C10012181)，其水溶性較低、毒性大，是常用的有機(jī)參比物質(zhì)。

1.2 方法

按照《OECD化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則No.215魚(yú)類(lèi)幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)》[8]和ISO關(guān)于測(cè)試方法和結(jié)果的準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)方法[9]進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)并制定試驗(yàn)方案，選用重鉻酸鉀和3,4-二氯苯胺兩種參比物質(zhì)，分別進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)室內(nèi)稀有鮈鯽幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性(repeatability)；同時(shí)邀請(qǐng)國(guó)內(nèi)同類(lèi)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展針對(duì)上述兩種參比物質(zhì)的比對(duì)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果的再現(xiàn)性(reproducibility)。

1.2.1 試驗(yàn)原理

將處于指數(shù)生長(zhǎng)階段的幼魚(yú)稱(chēng)重后放入試驗(yàn)容器中，并在受試物的亞致死濃度范圍內(nèi)進(jìn)行更新式暴露，試驗(yàn)周期為28 d。每天投餌，投餌量根據(jù)魚(yú)的初始重量計(jì)算。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，再次對(duì)試驗(yàn)魚(yú)稱(chēng)重。通過(guò)回歸模型來(lái)估計(jì)引起20%生長(zhǎng)率變化的濃度(EC20)，從而分析對(duì)其生長(zhǎng)率的影響；通過(guò)與空白對(duì)照組的比較可以確定最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)以及無(wú)可觀察效應(yīng)濃度(NOEC)。

1.2.2 試驗(yàn)條件

試驗(yàn)用水為經(jīng)活性炭過(guò)濾，紫外滅菌的自來(lái)水，pH 6.0～8.5，總硬度不低于 140 mg/L(以 CaCO3計(jì))；溫度(23±2)℃；每天12 h光照；溶解氧不小于空氣飽和值的60%。飼喂：每日投食2次且間隔至少5 h，投食總量約為每個(gè)容器中所有魚(yú)初始體重的4%，稱(chēng)重前24 h內(nèi)不飼喂。清污：每次更換試驗(yàn)溶液時(shí)，將原有試驗(yàn)容器替換為充分洗凈的試驗(yàn)容器。

1.2.3 試驗(yàn)操作

暴露濃度：重鉻酸鉀暴露組為10、15、22、33、50 mg/L，3,4-二氯苯胺暴露組為20、36、64、112、200 μg/L，同時(shí)設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組(試驗(yàn)用水)；各組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行容器放入5尾魚(yú)。每次試驗(yàn)需使用90尾魚(yú)。

試驗(yàn)開(kāi)始前，選擇試驗(yàn)魚(yú)中有代表性的個(gè)體，用80 mg/L 間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)麻醉后，測(cè)量平均體重。在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，對(duì)所有試驗(yàn)用魚(yú)逐尾稱(chēng)重，所有個(gè)體重量應(yīng)保持在平均體重的±10%范圍內(nèi)，最大不能超過(guò)25%。將試驗(yàn)魚(yú)在試驗(yàn)容器之間隨機(jī)分配，并記錄每個(gè)試驗(yàn)容器中魚(yú)的總重量。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)所有存活的魚(yú)按試驗(yàn)容器逐尾稱(chēng)重。試驗(yàn)期間，不進(jìn)行測(cè)量。

觀察和記錄：每日一次觀察并記錄魚(yú)死亡數(shù)量和其他異?，F(xiàn)象，如體表出血、變色等。死魚(yú)應(yīng)及時(shí)清除，且需重新調(diào)整投餌量。

試驗(yàn)期間，測(cè)定一次空白對(duì)照組和最高濃度組中的總硬度；至少在一個(gè)試驗(yàn)容器中連續(xù)監(jiān)測(cè)溫度。

至少在每次更新試驗(yàn)溶液前后測(cè)定各試驗(yàn)容器中溶液pH、溶解氧和溫度。

1.2.4 試驗(yàn)有效性判斷

試驗(yàn)期間，試驗(yàn)溶液的溶解氧含量應(yīng)>60%ASV；各試驗(yàn)容器之間的水溫波動(dòng)不超過(guò)±1℃，并且應(yīng)保持在試驗(yàn)生物適宜溫度的±2℃范圍內(nèi)。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組試驗(yàn)魚(yú)的死亡率不得超過(guò)10%，且對(duì)照組試驗(yàn)魚(yú)平均體重的增長(zhǎng)至少為初始體重的50%。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)

重鉻酸鉀和3，4-二氯苯胺稀有鮈鯽幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各實(shí)施三次，通過(guò)固定試驗(yàn)條件和方法，在不同時(shí)間、不同操作人員、不同受試生物個(gè)體，比較分析試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)試驗(yàn)

為評(píng)價(jià)兩種參比物質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果的再現(xiàn)性，邀請(qǐng)五家外部實(shí)驗(yàn)室參加稀有鮈鯽幼體生長(zhǎng)比對(duì)試驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)室位于我國(guó)不同區(qū)域，其中華東2家，東北1家，華中1家，西南1家。為了保證數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性和可比性，比對(duì)試驗(yàn)由本實(shí)驗(yàn)室制定試驗(yàn)方案，統(tǒng)一分發(fā)受試物質(zhì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 平均特定生長(zhǎng)率

平均特定生長(zhǎng)率是指某個(gè)試驗(yàn)濃度中整個(gè)容器中魚(yú)的平均生長(zhǎng)率，計(jì)算公式(1)如下：

(1)

1.3.2 結(jié)果的回歸分析

將各暴露組的平均特定生長(zhǎng)率(r)與空白對(duì)照組平均特定生長(zhǎng)率(r0)進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算得出以特定生長(zhǎng)率為基礎(chǔ)的抑制率(Ir)，再運(yùn)用概率單位法分析抑制率(Ir)與濃度之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，可估算ECx，即任何所需EC值。計(jì)算生長(zhǎng)抑制率(Ir)的公式(2)如下：

(2)

(2)式中，Ir： 以特定生長(zhǎng)率為基礎(chǔ)的抑制率，%；r0、r分別為空白對(duì)照組平均特定生長(zhǎng)率和暴露組平均特定生長(zhǎng)率。

1.3.3 LOEC和NOEC的估計(jì)結(jié)果分析

采用Dunnett’s t檢驗(yàn)將各暴露組平均特定生長(zhǎng)率(r)與空白對(duì)照組平均特定生長(zhǎng)率(r0)進(jìn)行對(duì)比，確定LOEC和NOEC值。

以上EC、LOEC和NOEC值均基于參比物質(zhì)在試驗(yàn)溶液中的配制濃度。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)

兩種參比物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)稀有鮈鯽幼體生長(zhǎng)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示(表1)，重鉻酸鉀和3,4-二氯苯胺三次試驗(yàn)結(jié)果的變異系數(shù)分別為11.3%和14.2%，均小于15%。兩種參考物質(zhì)在三次試驗(yàn)中得到的LOEC和NOEC值均一致。這表明在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部開(kāi)展的稀有鮈鯽幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性好。

表1 重復(fù)試驗(yàn)中兩種參比物質(zhì)對(duì)稀有鮈鯽28 d生長(zhǎng)抑制效應(yīng)濃度(28 d EC20)Table 1 Effects of the two reference chemicals on the specific growth rate of Gobiocypris rarus after 28 d of exposure (28 d EC20) in the repeated tests

2.2 實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)試驗(yàn)

所有參加比對(duì)試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室均按照統(tǒng)一的試驗(yàn)方案開(kāi)展稀有鮈鯽幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)，試驗(yàn)用水水質(zhì)參數(shù)(溫度、pH、溶解氧濃度、硬度等)的波動(dòng)和試驗(yàn)用魚(yú)的選擇均符合質(zhì)量控制要求。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各次試驗(yàn)對(duì)照組試驗(yàn)魚(yú)的死亡率均為0，且平均體重的增長(zhǎng)超過(guò)初始體重的50%，均符合試驗(yàn)有效性要求。

通過(guò)Dunnett’st檢驗(yàn)，將各暴露組的平均特定生長(zhǎng)率均值與空白對(duì)照組進(jìn)行比較，獲取28 d生長(zhǎng)抑制效應(yīng)的LOEC和NOEC。各實(shí)驗(yàn)室重鉻酸鉀比對(duì)的LOEC在15～33 mg/L之間，NOEC在10～22 mg/L之間(圖1)。通過(guò)回歸分析，建立暴露濃度與抑制效應(yīng)的關(guān)系曲線，獲取EC20，各實(shí)驗(yàn)室重鉻酸鉀比對(duì)結(jié)果范圍在17.9～30.4 mg/L之間(圖2)。同樣，在3,4-二氯苯胺比對(duì)試驗(yàn)中，LOEC和NOEC分別在36～112 μg/L和 20～64 μg/L范圍內(nèi)(圖3)，EC20在58.4～198 μg/L之間(圖4)。

注：APM1代表上海市檢測(cè)中心實(shí)驗(yàn)室第一次試驗(yàn)的結(jié)果，余同。圖1 各實(shí)驗(yàn)室重鉻酸鉀對(duì)稀有鮈鯽特定生長(zhǎng)率的28 d LOEC和NOECNote. APM1 stands for the result obtained from the first test by the Shanghai Academy of Public Measurement, and the same can be seen in other figures.Figure 1 The LOEC and NOEC of potassium dichromate on the specific growth rate of G. rarus after 28-d exposure for each participating laboratory

圖2 各實(shí)驗(yàn)室重鉻酸鉀對(duì)稀有鮈鯽特定生長(zhǎng)率的28 d EC20及其95%置信限Figure 2 EC20 values with 95% confidence limits of potassium dichromate on the specific growth rate of G. rarus after 28-d exposure for each participating laboratory

圖3 各實(shí)驗(yàn)室3,4-二氯苯胺對(duì)稀有鮈鯽特定生長(zhǎng)率的28 d LOEC和NOECFigure 3 LOEC and NOEC of 3,4-dichloroaniline on the specific growth rate of G. rarus after 28-d exposure for each participating laboratory

圖4 各實(shí)驗(yàn)室3,4-二氯苯胺對(duì)稀有鮈鯽特定生長(zhǎng)率的28 d EC20及其95%置信限Figure 4 EC20 estimates with 95% confidence limits of 3,4-dichloroaniline on the specific growth rate of G. rarus after 28-d exposure for each participating laboratory

3 討論

魚(yú)類(lèi)幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)(OECD TG 215)選取處于指數(shù)生長(zhǎng)階段的幼魚(yú)進(jìn)行為期28 d的毒性試驗(yàn)，觀察受試物的亞致死效應(yīng)以及分析其對(duì)生長(zhǎng)率的影響[7]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)生物的生命周期排列，該測(cè)試方法之前有魚(yú)類(lèi)胚胎-卵黃囊吸收階段的短期毒性試驗(yàn)(OECD TG 212)[11]、魚(yú)類(lèi)早期生活階段毒性試驗(yàn)(OECD TG 210)[12]，之后有魚(yú)類(lèi)短期繁殖試驗(yàn)(OECD TG 229)[13]或魚(yú)類(lèi)性發(fā)育試驗(yàn)(OECD TG 234)[14]，處于一個(gè)承前啟后的位置，且技術(shù)難度較小，實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)工作相對(duì)容易開(kāi)展。

魚(yú)類(lèi)幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)從方法開(kāi)發(fā)之初，其間開(kāi)展比對(duì)驗(yàn)證，到最終形成OECD導(dǎo)則，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)都是受試魚(yú)種或推薦魚(yú)種。英國(guó)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)項(xiàng)目中，3,4-二氯苯胺對(duì)虹鱒的28 d LOEC在30～220 μg/L范圍內(nèi)[15]，而之后的歐洲多家實(shí)驗(yàn)室的比對(duì)研究得到了一個(gè)略大的28 d LOEC范圍(100～600 μg/L)[16]。而在本研究中，國(guó)內(nèi)各實(shí)驗(yàn)室的3,4-二氯苯胺對(duì)稀有鮈鯽的28 d LOEC在36～112 μg/L之間，表明稀有鮈鯽對(duì)3,4-二氯苯胺的敏感性與虹鱒大致接近，這使得將稀有鮈鯽列為魚(yú)類(lèi)幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)的受試生物具備可行性。

任何一項(xiàng)試驗(yàn)研究在實(shí)施過(guò)程中都會(huì)出現(xiàn)各種來(lái)源的變異(variations)。就魚(yú)類(lèi)幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)而言，除了幼魚(yú)個(gè)體內(nèi)在的生長(zhǎng)率差異，試驗(yàn)體系中試驗(yàn)魚(yú)的承載量、水溫及其波動(dòng)幅度、溶解氧含量、投餌量及飼喂頻率等因素都可能對(duì)最終的試驗(yàn)結(jié)果造成不同程度的變異，操作人員和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境設(shè)施的差異會(huì)進(jìn)一步加劇這種情況，故同一項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室間變異通常比實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異大。然而，只要關(guān)鍵性的試驗(yàn)條件受到嚴(yán)格控制，這些潛在的變異將不會(huì)對(duì)試驗(yàn)方法的靈敏度產(chǎn)生顯著的影響。

本研究的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了魚(yú)類(lèi)幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)方法的穩(wěn)健性[16]。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部研究顯示，兩種參比物質(zhì)重復(fù)性試驗(yàn)得到的LOEC和NOEC值均是一致的，28 d EC20值的變異系數(shù)小，表明試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性良好。這說(shuō)明只要選擇來(lái)源固定、魚(yú)齡適宜、初始體重差異小的稀有鮈鯽幼魚(yú)，在暴露條件相同的前提下，即使是不同人員在不同時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)操作，都能夠獲得一致性較高的試驗(yàn)結(jié)果。

在比對(duì)研究中，各家實(shí)驗(yàn)室均按照統(tǒng)一的試驗(yàn)方案完成了兩種參比物質(zhì)的稀有鮈鯽幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)。各實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)的離散程度(變異系數(shù))相較于同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)數(shù)據(jù)的離散程度大，尤其是3,4-二氯苯胺的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，變異系數(shù)高達(dá)42.1%，可能是由于該物質(zhì)難溶于水、毒性效應(yīng)濃度低、試驗(yàn)技術(shù)難度較大所致。與此相反，對(duì)于水溶性高、性質(zhì)穩(wěn)定的重鉻酸鉀，比對(duì)試驗(yàn)的變異系數(shù)(17.3%)與重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)(11.3%)差異不大。同其他實(shí)驗(yàn)室的數(shù)值相比，4號(hào)實(shí)驗(yàn)室提供的兩種參比物質(zhì)EC20值均是最小的，即便如此，最大值與最小值之比未超出一個(gè)數(shù)量級(jí)，而z分?jǐn)?shù)法的評(píng)價(jià)結(jié)果也進(jìn)一步印證了比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的再現(xiàn)性。另外，根據(jù)新化學(xué)物質(zhì)危害評(píng)估導(dǎo)則[17]判定受試物質(zhì)危害等級(jí)判定時(shí)，數(shù)據(jù)上的差異并未對(duì)毒性分級(jí)造成影響。

與魚(yú)類(lèi)急性毒性試驗(yàn)相比，魚(yú)類(lèi)幼體生長(zhǎng)試驗(yàn)對(duì)受試生物、試驗(yàn)條件、觀察終點(diǎn)、數(shù)據(jù)分析等各方面的技術(shù)要求更為復(fù)雜。為了準(zhǔn)確描述受試化學(xué)物的毒性特征，試驗(yàn)數(shù)據(jù)需要滿足統(tǒng)計(jì)功效，才能將不同暴露濃度組間幼體生長(zhǎng)差異與各濃度組中容器內(nèi)個(gè)體差異或容器間差異有效區(qū)分開(kāi)來(lái)。實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的一個(gè)關(guān)鍵因素就是挑選出一批初始體重差異較小(所有個(gè)體重量須保持在平均體重的±10%范圍內(nèi))的試驗(yàn)用幼魚(yú)。稀有鮈鯽幼魚(yú)個(gè)體(0.05～0.10 g)遠(yuǎn)小于OECD TG 215[8]首選的虹鱒幼魚(yú)(3～5 g)，這給動(dòng)物的移動(dòng)、稱(chēng)量和篩選帶來(lái)一定技術(shù)難度。然而，使用小型魚(yú)種也有一些優(yōu)勢(shì)，比如可以縮小試驗(yàn)體系的規(guī)模，減少配制試驗(yàn)溶液的工作量。另外還需注意的是，試驗(yàn)期間務(wù)必消除或盡量減小環(huán)境因素(尤其是溫度差異)對(duì)幼體生長(zhǎng)速率造成的影響，除了將水溫波動(dòng)嚴(yán)格控制在1℃以內(nèi)，還應(yīng)該定期變換容器位置。

幼魚(yú)對(duì)環(huán)境壓力的耐受程度遠(yuǎn)不及成魚(yú)，不適合遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，建議有條件的實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)部維持適量的稀有鮈鯽種群，以便試驗(yàn)的順利開(kāi)展。目前實(shí)驗(yàn)稀有鮈鯽的養(yǎng)殖和病原體控制有些研究，但未形成規(guī)范性體系，這需要各相關(guān)機(jī)構(gòu)不斷積累實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)、深入研究，盡快形成技術(shù)規(guī)范，為稀有鮈鯽國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)體系的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

總之，無(wú)論是試驗(yàn)物種的敏感性，還是試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和再現(xiàn)性，均證實(shí)了稀有鮈鯽在魚(yú)類(lèi)幼體試驗(yàn)方法中的適用性。只要相關(guān)研究機(jī)構(gòu)繼續(xù)遵從與國(guó)際一致的標(biāo)準(zhǔn)化原則，在化學(xué)品測(cè)試實(shí)踐中不斷累積物種穩(wěn)定性和敏感性數(shù)據(jù)，稀有鮈鯽在化學(xué)品毒性測(cè)試中的使用范圍將有望進(jìn)一步擴(kuò)大。