張歡歡，方杰，俞文英，楊揚(yáng)，余陳歡，應(yīng)華忠

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心，浙江省實(shí)驗(yàn)動物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310013)

肝纖維化表現(xiàn)為肝內(nèi)細(xì)胞間基質(zhì)(ECM)蛋白過度表達(dá)和膠原沉積，是肝對各種因子刺激導(dǎo)致的慢性炎癥進(jìn)行異常修復(fù)的結(jié)果，如不及時治療則會轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡娴母斡不?，甚至發(fā)展為肝癌[1]。肝星狀細(xì)胞(HSC)向成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并合成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，即肝星狀細(xì)胞活化，是肝纖維化的“中心事件”。抑制HSC活化、增殖或者促進(jìn)HSC凋亡能夠逆轉(zhuǎn)肝纖維化[2]。

MicroRNAs (miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小約20～25個核苷酸，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。某些miRNAs參與調(diào)控肝纖維化及肝癌[4]，其中miR34c 在活化的HSC中表達(dá)上調(diào)[5]，并通過靶向肝星狀細(xì)胞乙酰輔酶A合成酶長鏈家族成員(ACSL1)和過氧化物酶體增殖因子活化受體γ(PPARγ)基因參與肝纖維化[6-7]。miR34c表達(dá)上調(diào)與肝纖維化程度成正相關(guān)，下調(diào)其表達(dá)水平可能阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化發(fā)展。

樹狀大分子材料(dendrimer)為高度分支結(jié)構(gòu)，具有很好的幾何對稱性和大量的表面官能團(tuán)，并可通過端基改性來獲得更多的功能性基團(tuán)[8]。5代聚酰胺-胺(PAMAM)樹狀大分子攜帶正電荷，能夠有效吸附帶負(fù)電荷的microRNA并維持較好的3D構(gòu)造，是理想的基因靶向治療轉(zhuǎn)染載體[9]。本研究應(yīng)用四氯化碳誘導(dǎo)裸鼠肝纖維化模型，報(bào)道PAMAM包裹的anti-miR34c納米顆粒能否達(dá)到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性裸鼠15只，體重(20±2)g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司【SCXK(滬)2013 - 0016】，飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心【SYXK(浙)2014 - 0008】。專用標(biāo)準(zhǔn)飼料、水喂養(yǎng)，所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求【倫理審批號：(2015)動倫審研第(06)號】。

1.1.2 藥品與試劑

Anti-miR34c由廣州銳博合成；PAMAM Dendrimer G5-NH2購自威海晨源分子新材料有限公司；四氯化碳和甲醛購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TGF-β和α-SAM抗體購自Abcam；血清AST、ALT、HA、ColIV、LN的ELISA試劑盒購自武漢博士德生物公司。

1.1.3 主要設(shè)備與儀器

馬爾文納米粒度電位儀，Zetasizer Nano ZS，英國；徠卡冰凍切片機(jī)， CM 1900，德國；徠卡熒光顯微鏡，DM2500，德國；MD多功能酶標(biāo)儀，SpectraMax M4，美國。

1.2 方法

1.2.1 靶向miR34c樹狀納米顆粒制備

anti-miR34c和PAMEM均用TE溶解，按照載體與DNA電荷比(N/P比)加入一定量的PAMAM，室溫溫育 20 min 后得到兩者的自組裝復(fù)合物。復(fù)合物中anti-miR34c終濃度為500 nmol/L，N/P比分別為5/1、15/1、20/1。馬爾文納米粒度電位儀測定納米粒徑、電位等。

1.2.2 動物模型建立、分組與給藥

清潔級(20±2)g 雄性裸鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、anti-miR34c樹狀納米顆粒治療組(治療組)，每組5只。模型組和治療組每周二、五注射20%四氯化碳100 μL，連續(xù)6周，正常組注射100 μL生理鹽水。治療組從第3周開始尾靜脈注射200 μL anti-miR34c樹狀納米顆粒，每周2次，在腹腔注射四氯化碳之前給藥。

1.2.3 血清生化指標(biāo)檢測

體積分?jǐn)?shù)3%戊巴比妥鈉溶液麻醉裸鼠后，打開腹腔取主動脈血，離心分離血清，采用ELISA試劑盒檢測AST、ALT、HA、ColIV、LN等指標(biāo)。

1.2.4 肝組織病理觀察

打開腹腔迅速取下肝組織并用4℃預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)洗凈，濾紙吸干表面水跡，稱濕重，按照肝組織濕重(g)/體重(g)×100%計(jì)算肝指數(shù)(g/g)。各組裸鼠取相同部位肝組織，10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～5 μm，進(jìn)行HE染色和masson染色，觀察肝組織病理和膠原沉積情況。

1.2.5 免疫組化檢測肝組織TGF-β和α-SAM表達(dá)

肝組織常規(guī)石蠟包埋與切片，高溫去蠟脫水，3% H2O2孵育25 min，滅活內(nèi)源性酶，滴加正常山羊血清，室溫孵育20 min。滴加TGF-β/α-SAM抗體(1∶200)， 4℃過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min，滴加SABC，37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察TGF-β/α-SAM表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Anti-miR34c樹狀納米顆粒的制備

如表1 所示，anti-miR34c終濃度為500 nmol/L時，電位為正電荷，表明anti-miR34c電荷被完全中和，與PAMAM形成穩(wěn)定復(fù)合物。N/P比為5/1粒徑較為穩(wěn)定，集中在650～720 nm之間，而N/P比越大，粒徑大小越不穩(wěn)定。聚合物分散指數(shù)(PDI，polymer dispersion index)越小，表面系統(tǒng)分散得越好，團(tuán)聚的傾向越小。PDI小于0.2的樹狀納米顆粒較為穩(wěn)定，用于裸鼠肝纖維化治療。

表1 不同氮磷比(N/P)anti-miR34c樹狀納米顆粒粒徑和zeta電位測定Table 1 Particle size and zeta potential of anti-miR34c and polyamidoamine complexes at different nitrogen/phosphorus(N/P) ratios

注：A. 肝指數(shù)，a/b/c表示各組數(shù)據(jù)P< 0.05。B. HE染色結(jié)果。C. masson染色結(jié)果。圖1 anti-miR34c樹狀納米顆粒對肝纖維化裸鼠肝組織病理的影響Note. (A) Liver index, significant differences between the groups a/b/c (P< 0.05). (B) HE staining. (C) Masson staining.Figure 1 Effects of anti-miR34c polyamidoamine nanoparticles on hepatic pathology in hepatic fibrosis of nude mice

2.2 Anti-miR34c樹狀納米顆粒對肝纖維化裸鼠肝組織病理的影響

如圖1A所示，正常對照組肝指數(shù)為(45±3.72)%，模型組升高到(66±2.90)%，差異有顯著性(P< 0.05)，而anti-miR34c樹狀納米顆粒治療組為(52±5.66)%，與模型組比較肝指數(shù)降低，差異有顯著性(P< 0.05)。HE染色結(jié)果顯示(圖1B)，正常對照組細(xì)胞排列均勻，無細(xì)胞間隙，也無炎癥浸潤，而模型組肝組織有明顯的纖維包裹和脂質(zhì)堆積，大量炎癥細(xì)胞浸潤，anti-miR34c治療后肝組織與正常組相近，細(xì)胞排列整齊，無纖維索，無脂質(zhì)堆積，masson染色結(jié)果(圖1C)也顯示治療組膠原沉積明顯減少，說明anti-miR34c能夠有效改善裸鼠肝纖維化。

2.3 Anti-miR34c樹狀納米顆粒對肝纖維化裸鼠血清生化指標(biāo)的影響

如表2所示，模型組血清ALT和AST含量分別是對照組的3.6倍和10倍，差異有顯著性(P< 0.05)，表明模型組肝損傷嚴(yán)重。血清HA、ColIV和LN水平也比對照組分別提高了120%、24%和61%，差異有顯著性(P< 0.05)，說明模型組膠原沉積明顯，纖維化水平較高。與模型組相比，anti-miR34c樹狀納米顆粒治療組血清AST、ALT、ColIV水平分別下調(diào)了61%、91%、19%，幾乎達(dá)到正常對照組含量，差異有顯著性(P< 0.05)，HA和LN也分別下調(diào)14%和3%，但差異無顯著性。

表2 anti-miR34c樹狀納米顆粒對血清生化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of anti-miR34c PAMAM nanoparticles on serum biochemical marker levels

注：血清生化指標(biāo)，a/bP< 0.05。

Note. serum biochemical markers，a/bP< 0.05。

2.4 Anti-miR34c樹狀納米顆粒對肝纖維化裸鼠肝組織TGF-β和α-SAM表達(dá)的影響

TGF-β是促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化并使之轉(zhuǎn)化為成纖維狀細(xì)胞的重要因子，肝組織免疫組化結(jié)果表明，與正常對照組相比，TGF-β在模型組的表達(dá)量顯著升高，而在靶向miR34c樹狀納米顆粒治療組又比模型組明顯降低。α-SAM主要表達(dá)于成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞中，是HSC活化的特征性蛋白，在正常對照組肝組織中表達(dá)很低，但是在纖維化模型組的纖維狀病理損傷處大量表達(dá)，而在無明顯纖維狀損傷的治療組中表達(dá)量下降(如圖2)。

注：A. 各組裸鼠肝組織TGF-β免疫組化結(jié)果；B. 各組裸鼠肝組織α-SAM免疫組化結(jié)果。圖2 anti-miR34c樹狀納米顆粒對肝纖維化裸鼠肝組織TGF-β和α-SAM表達(dá)的影響Note. Immunohistochemistry for (A) TGF-β and (B) α-SAM in the liver.Figure 2 Effects of anti-miR34c PAMAM nanoparticles on liver transforming growth factor -β(TGF-β)/α-smooth muscle cell actin (α-SMA) levels

3 討論

MiR34家族成員調(diào)節(jié)參與細(xì)胞周期、凋亡、分化和發(fā)育的多種基因表達(dá)[10]，其在多種腫瘤疾病中表達(dá)下調(diào)，被認(rèn)為是抑癌因子[11]。但在多種肝疾病中miR34卻表達(dá)上調(diào)，包括非酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝癌等[12]。研究證實(shí)miR34可以靶向ACLS1蛋白參與HSC脂質(zhì)代謝和細(xì)胞存活[6]，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化發(fā)展。其中miR34c也可以通過靶向調(diào)節(jié)PPARγ表達(dá)活化HSC[7]。因此，miR34c是治療肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。本研究給予肝纖維化裸鼠模型anti-miR34c樹狀納米顆粒，有效減少了肝組織纖維樣疤痕、減輕了膠原沉積，血清肝損傷生化指標(biāo)ALT和AST以及胞外基質(zhì)蛋白HA、ColIV和LN含量均下降，說明anti-miR34c樹狀納米顆粒明顯改善了裸鼠肝纖維化病理狀態(tài)。

TGF-β是目前公認(rèn)最重要的致纖維化細(xì)胞因子[13]，不僅能促進(jìn)HSC的增殖及肝纖維化相關(guān)膠原的分泌，還可促進(jìn)肝內(nèi)各種細(xì)胞合成和分泌 TGF-β、EGF 等促纖維化細(xì)胞因子，進(jìn)一步激活 HSC，促進(jìn)ECM分泌[14]。α-SAM則是成纖維樣細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，可以反映HSC活化。本研究肝組織TGF-β和α-SAM免疫組化結(jié)果顯示，anti-miR34c樹狀納米顆粒降低了肝組織TGF-β表達(dá)并抑制HSCs活化，逆轉(zhuǎn)了四氯化碳造成的肝纖維化。

MicroRNAs帶較強(qiáng)的負(fù)電荷并具有親水性，很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且在血管內(nèi)很容易降解[15]，因此安全高效的輸送載體尤為重要。PAMAM樹狀大分子是一類高度支化的單分散大分子，具有明顯的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[16]：(1)核心區(qū)；(2)向外延伸的樹狀分支；(3)表面攜帶大量的功能基團(tuán)。5代PAMAM攜帶的正電荷能夠與microRNA的負(fù)電荷相吸，使其穩(wěn)定吸附于材料上。3D球面構(gòu)型能夠很好的保護(hù)microRNA在細(xì)胞內(nèi)免受降解[9]，緩慢釋放microRNA在靶細(xì)胞內(nèi)長期作用。Ren等采用PAMAM將miR-21靶向膠質(zhì)瘤細(xì)胞顯著抑制其生長[17]，表明PAMAM是microRNA體外治療的有效運(yùn)送載體。本研究采用PAMAM 樹狀大分子將anti-miR34c輸送到肝組織，實(shí)現(xiàn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)，表明PAMAM也能夠攜microRNA進(jìn)行體內(nèi)治療。