陳靜，姚薇，韓克光*，鄭明學(xué)，古少鵬，張鼎，田文霞，霍乃蕊*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801； 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院，山西 太谷 030801)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一種常見(jiàn)的全身性骨代謝病[1]，正常的骨代謝過(guò)程中，骨吸收和骨形成處于動(dòng)態(tài)平衡。研究表明OP發(fā)生時(shí)，OC過(guò)度形成和活化，骨吸收活性異常增加，導(dǎo)致骨流失加快，骨量減少，骨質(zhì)劣變[2-3]。因此抑制OC形成及其骨吸收活性是OP防治的一個(gè)重要策略。鈣制劑在OP防治中的作用，已被大量研究證實(shí)[4]。作為第四代鈣制劑，肽鈣螯合物溶解性和解離性好，生物利用度高，且其中的肽可促進(jìn)鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收[5]。

課題組前期研究結(jié)果已證實(shí)了羊骨髓肽(sheep bone marrow polypeptides，MP)及其鈣螯合物(MP-Ca)對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的防治效果[6]。本研究將以RAW264.7為破骨前體細(xì)胞，建立OC的RANKL誘導(dǎo)體系，研究MP和MP-Ca對(duì)OC誘導(dǎo)形成和活性的影響，并將二者的效果進(jìn)行比較，揭示其抑制OP發(fā)生的機(jī)制，為OP防治藥物研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

MP由內(nèi)蒙古錫林郭勒盟肽好生物制品有限責(zé)任公司生產(chǎn)、分離和純化，以干基計(jì)，蛋白含量為96%。小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7和RPMI 1640不完全培養(yǎng)基購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。完全培養(yǎng)基在不完全培養(yǎng)基中補(bǔ)充10%的胎牛血清(浙江)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒、TRAP酶活性檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成科技有限公司；MTT試劑盒與Triton X-100為Solarbio產(chǎn)品；RANKL和0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液分別為美國(guó)Peprotech和Sigma產(chǎn)品；茚三酮試劑。

JEOL JEM-6490LV掃描電子顯微鏡(日本電子光學(xué)實(shí)驗(yàn)室，日本)；6孔和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning，美國(guó))；Olympus CX21倒置相差顯微鏡；MC721酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(上海箐華科技儀器有限公司)。

1.2 MP-Ca的制備與鑒定

以MP和CaCl2為原料，按照實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的螯合工藝制備MP-Ca凍干粉[7-8]。對(duì)MP-Ca鑒定時(shí)，先對(duì)其進(jìn)行純化，除去樣品中的游離的氨基酸和肽，具體操作為：在MP-Ca溶液中加5～8滴茚三酮試劑，加熱至沸騰，若溶液變?yōu)樗{(lán)紫色，說(shuō)明樣品中仍有游離的氨基酸或小肽，需要繼續(xù)對(duì)樣品進(jìn)行醇沉純化，直至加入茚三酮試劑不再變色。溶解純化后的MP-Ca樣品，加入過(guò)量的硫化鈉，振蕩搖勻，放置一段時(shí)間，若有硫化鈣沉淀生成，說(shuō)明鈣離子來(lái)自于肽鈣螯合物，過(guò)濾掉沉淀，濾液中加入茚三酮試劑，如果顏色變?yōu)樗{(lán)紫色，說(shuō)明溶液中的肽來(lái)自肽鈣螯合物。

取適量MP和MP-Ca樣品送至山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，進(jìn)行掃描電鏡分析。

1.3 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)體系的建立

RAW264.7細(xì)胞用完全培養(yǎng)基于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，換液培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁達(dá)到瓶底面積70% ～80%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，收集消化液，1000 r/min離心5 min，細(xì)胞用完全培養(yǎng)基重懸后傳代。

取對(duì)數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞用含RANKL(終濃度為50 ng/mL)的完全培養(yǎng)基制成濃度為104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。在6孔培養(yǎng)板小孔中預(yù)置無(wú)菌蓋玻片(1 cm × 1 cm)和骨片(0.5 cm × 0.5 cm，厚20 μm)，每孔加入1 mL上述細(xì)胞懸液，培養(yǎng)約4 h，待細(xì)胞貼壁后在小孔中補(bǔ)加含50 ng/mL RANKL的培養(yǎng)基，隔天換液，期間觀察細(xì)胞形態(tài)。

于培養(yǎng)第3天開(kāi)始，每24 h取出一枚蓋玻片和骨片，蓋玻片按TRAP染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行TRAP染色，骨片超聲清洗后，梯度乙醇脫水，自然晾干，1%甲苯胺藍(lán)室溫染色3～4 min，蒸餾水洗。將蓋玻片和骨片置光鏡下觀察，確定破骨細(xì)胞誘導(dǎo)形成的時(shí)間。

1.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及受試物的最適干預(yù)濃度

96孔板上，RAW264.7細(xì)胞(104個(gè)/mL)的接種量為100 μL/孔，誘導(dǎo)組小孔中RANKL的終濃度為50 ng/mL，對(duì)照組小孔不加RANKL。每組8個(gè)平行，每個(gè)平行5個(gè)復(fù)孔，每天取一個(gè)平行進(jìn)行測(cè)定，各孔按照MTT試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，并測(cè)定OD490值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，確定OD490峰值所對(duì)應(yīng)的檢測(cè)天數(shù)，并以此作為確定各受試物最適作用濃度時(shí)的檢測(cè)時(shí)間。

按1.3建立誘導(dǎo)體系，以不同濃度的受試物干預(yù)RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞向OC分化的過(guò)程。MP，MP-Ca濃度分別為0，10，102，103，104，105μg/mL，17β-雌二醇(E2)濃度為0，1，10，102，103，104μg/mL，于培養(yǎng)第5天用MTT法進(jìn)行檢測(cè)，確定各受試物的最適作用濃度。

1.5 最適作用濃度下受試物對(duì)破骨前體細(xì)胞分化增殖的影響

按1.3建立誘導(dǎo)體系，以等體積最適作用濃度的MP，MP-Ca及E2干預(yù)RAW264.7的RANKL誘導(dǎo)分化的過(guò)程，同時(shí)設(shè)空白組，每組10個(gè)平行，每個(gè)平行5個(gè)復(fù)孔，每隔24 h進(jìn)行MTT測(cè)定，記錄OD490值并繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。其中一個(gè)平行與骨磨片共培養(yǎng)，于第5天進(jìn)行骨吸收陷窩計(jì)數(shù)，另取一個(gè)平行于第5天測(cè)定TRAP活性。

1.6 TRAP活性的測(cè)定

吸棄培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS洗滌兩次，每孔加入200 μL 0.2% Triton X-100裂解細(xì)胞。取100 μL細(xì)胞裂解液，按TRAP酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，測(cè)定OD405值。另取100 μL細(xì)胞裂解液按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行操作并測(cè)定OD562值。按式(1)將OD562值換算成細(xì)胞裂解液總蛋白濃度，式中標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為563 μg/mL。

定義在pH 4.8、37℃條件下，每分鐘水解para-nitrophenyl phosphate(PNPP)顯色底物產(chǎn)生1 μmol p-nitrophenol呈色物所需的酸性磷酸酶的量為一個(gè)酶活力單位(U)。以總蛋白濃度作對(duì)照，TRAP活性以TRAP比活力表示，按式(2)進(jìn)行計(jì)算。

(1)

(2)

1.7 骨吸收陷窩的計(jì)數(shù)

骨片取出后，按1.3描述經(jīng)1%甲苯胺藍(lán)染色后，100倍光鏡下計(jì)數(shù)整張骨片的吸收陷窩數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件和Sigma Plot 10.0軟件處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，P< 0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 MP-Ca的鑒定

制備的MP-Ca經(jīng)純化后加入過(guò)量Na2S，生成了CaS沉淀和游離肽(顯色反應(yīng)呈陽(yáng)性)，說(shuō)明鈣離子和肽結(jié)合形成了螯合物。在掃描電鏡下，MP與Ca2+螯合后，其疏松的片狀結(jié)構(gòu)表面增加了顆粒性物質(zhì)，類似于鹽的結(jié)構(gòu)，這表明MP與鈣離子發(fā)生了螯合，形成了羧酸鹽和胺鹽。(見(jiàn)圖1)

2.2 破骨細(xì)胞鑒定

RAW264.7細(xì)胞加入RANKL培養(yǎng)24 h，光鏡下可見(jiàn)部分細(xì)胞開(kāi)始融合，培養(yǎng)72 h出現(xiàn)了具有典型OC形態(tài)的細(xì)胞，可觀察到胞體較大，邊緣不整齊，周圍有刷狀緣(褶皺)，有偽足的細(xì)胞(圖2-左)，第5天觀察時(shí)視野中基本都是此類細(xì)胞。第6天部分細(xì)胞胞體縮小，第7天細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞裂解。第3天檢測(cè)時(shí)，共培養(yǎng)的蓋玻片經(jīng)TRAP染色可觀察到胞漿內(nèi)形成棕紅色沉淀(圖2-中)；誘導(dǎo)培養(yǎng)至第5天，共培養(yǎng)的骨片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色可觀察到清晰的吸收陷窩(圖2-右)。

綜上，破骨前體細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)4 h貼壁后，以50 ng/mL RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h，分化形成具有典型細(xì)胞形態(tài)特征和骨吸收活性的成熟OC，所以第5天檢測(cè)到的細(xì)胞為成熟的OC。

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

由圖3可以看出，第1天檢測(cè)時(shí)，誘導(dǎo)組和對(duì)照組的OD490值大致相同，兩組細(xì)胞都在第5天達(dá)到峰值，隨后直接進(jìn)入凋亡期。第2天檢測(cè)時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞直接進(jìn)入對(duì)數(shù)期，而誘導(dǎo)組細(xì)胞的OD490值沒(méi)有升高。對(duì)數(shù)期內(nèi)誘導(dǎo)組每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)的OD490值均低于對(duì)照組。此結(jié)果與2.2中的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果吻合，所以在確定各受試物的最適作用濃度時(shí)，選擇第5天作為MTT法的檢測(cè)點(diǎn)。

圖1 MP(左)和MP-Ca(右)的掃描電鏡圖片(×2000)Figure 1 Scanning electron microscopic images of MP (left) and MP-Ca (right) (×2000)

圖2 RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)(左，×40)、TRAP染色結(jié)果(中，×100)及骨吸收陷窩(右，×100)Figure 2 Morphology (left, × 40), TRAP staining (middle, ×100) of RANKL-induced RAW264.7 cells, and pits formed in bone slice (right, ×100)

圖3 經(jīng)RANKL誘導(dǎo)和未經(jīng)RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Figure 3 Growth curves of RANKL-induced and non-induced RAW264.7 cells

2.4 MP和MP-Ca對(duì)OC誘導(dǎo)形成的影響

以不同濃度的受試物干預(yù)誘導(dǎo)過(guò)程，于第5天進(jìn)行檢測(cè)，由圖4可知，隨著濃度的增加，MP、MP-Ca、E2組的OD490值總體呈下降趨勢(shì)，達(dá)到最低值后，OD490值保持相對(duì)穩(wěn)定，因此確定MP和MP-Ca的最適作用濃度為103μg/mL、17β-雌二醇為10 μg/mL。

圖4 各受試物的不同濃度對(duì)破骨細(xì)胞誘導(dǎo)形成的影響Figure 4 Effects of test substance concentration on the formation of RANKL-induced osteoclasts

在含等量RAW264.7細(xì)胞的誘導(dǎo)體系中添加最適作用濃度的受試物，MTT法測(cè)定并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，如圖5(A～C)所示，E2、MP和MP-Ca干預(yù)組的OD490起始值相同，但在第2～8天OD490值均低于空白組，說(shuō)明各受試物對(duì)破骨前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和增殖均有抑制作用。由圖5-D可知，各干預(yù)組第5天的OD490值均顯著低于空白組，且MP-Ca組顯著低于MP組，但顯著高于E2組(P< 0.05)。

2.5 MP和MP-Ca對(duì)TRAP活性和骨吸收陷窩數(shù)的影響

圖6中各干預(yù)組細(xì)胞裂解液中的TRAP活性均顯著低于空白組(P< 0.05)。E2組TRAP活性最低，MP-Ca組顯著低于MP組(P< 0.05)。各干預(yù)組的骨吸收陷窩形成數(shù)均顯著低于空白組(P< 0.05)，E2組陷窩數(shù)最少，MP組顯著低于MP-Ca組(P< 0.05)。

注：5-D中柱上方不同的字母表示各組之間差異有顯著性(P< 0.05)，圖6與此相同。圖5 MP、MP-Ca、E2干預(yù)組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(A～C)及第5天各組OD490值比較(D)Note. Different lower case letters above each column in 5-D indicate statistically significant differences (P< 0.05), The same as in Figure 6.Figure 5 Growth curves of MP-, MP-Ca-, and 17-β-estradiol-intervened RAW264.7 cells that were induced with RANKL (A-C) and comparisons of the OD490 of different groups on day 5 (D)

圖6 MP、MP-Ca、E2干預(yù)組細(xì)胞的TRAP活性和骨吸收陷窩數(shù)比較Figure 6 Comparison of TRAP activity and lacuna numbers formed in the MP-, MP-Ca-, and 17-β-estradiol-intervened groups

3 討論

肽與鈣結(jié)合可形成穩(wěn)定的肽鈣螯合物[9]。茚三酮化學(xué)反應(yīng)法和電鏡觀察結(jié)果均表明MP與Ca2+發(fā)生了螯合，證明MP-Ca制備成功。MP-Ca既可滿足動(dòng)物對(duì)氨基酸的需求，又可促進(jìn)鈣的吸收[10]。

目前抑制骨吸收的藥物多為雙磷酸鹽類、激素類藥物及中藥等[11]。盡管許多研究證實(shí)了多肽鈣制劑對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松癥的防治效果[7,12]，但有關(guān)其對(duì)骨吸收抑制作用的研究，報(bào)道較少[13]。

TRAP被認(rèn)為是破骨前體細(xì)胞向OC分化過(guò)程中產(chǎn)生的標(biāo)志性酶，其活性高低能反映OC的分化程度[14]。融合形成的多核巨細(xì)胞雖然呈TRAP陽(yáng)性，但不具有骨吸收活性，只有最后真正成熟的OC方具有骨吸收活性[15]。本研究在第2天觀察時(shí)個(gè)別細(xì)胞發(fā)生融合，第3天便可檢測(cè)到TRAP活性，但處于此分化階段的細(xì)胞沒(méi)有骨吸收活性，第4天開(kāi)始，具有刷狀緣的成熟OC細(xì)胞數(shù)開(kāi)始增多，第5天達(dá)到高峰并可檢測(cè)到骨吸收陷窩。

MTT法是檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞增殖情況的常用方法[16]。本研究表明最適濃度的受試物只減少破骨前體細(xì)胞分化過(guò)程中的活細(xì)胞數(shù)目，不改變生長(zhǎng)曲線中峰值出現(xiàn)的時(shí)間，此結(jié)果與吳慶儒等[14]相同。本研究MTT法及TRAP活性檢測(cè)結(jié)果表明，相同最適作用濃度時(shí)，MP-Ca對(duì)OC誘導(dǎo)形成的抑制作用強(qiáng)于MP?；钴S的OC會(huì)分泌酸性物質(zhì)和酶對(duì)礦化的骨基質(zhì)進(jìn)行分解吸收[17]，骨吸收陷窩的數(shù)量、大小和深度能直接反應(yīng)OC的骨吸收能力[18]。MP及MP-Ca均能顯著減少骨吸收陷窩的數(shù)目，MP組陷窩數(shù)目顯著少于MP-Ca組，但單一的數(shù)目變化不足以說(shuō)明OC骨吸收活性的變化，并不表明MP組的骨吸收活性一定低于MP-Ca組，除骨吸收數(shù)目外，還應(yīng)考慮吸收陷窩的面積和深度。

綜上，在RAW264.7的RANKL誘導(dǎo)體系中，MP和MP-Ca均可抑制破骨前體細(xì)胞的增殖和分化，并抑制OC的骨吸收功能，并且MP-Ca對(duì)OC誘導(dǎo)形成的抑制作用強(qiáng)于MP，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。