石桂英，李珂雅，徐艷峰，韓云林，高舒平

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所, 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 干細(xì)胞與臨床轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

自從Zuk 等[1-2]從人體脂肪抽取物中成功分離出了具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞以來，脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cells, ADSCs)由于與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有自我更新能力、血管再生潛能、免疫調(diào)節(jié)能力，可以在體外分離、擴(kuò)增、誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等[3-6],已經(jīng)是干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。雪貂(Mustela pulourius furo)是食肉類動(dòng)物，屬于鼬科，作為新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由于他們的大腦功能和生殖生物學(xué)的生理特征以及各種疾病的特征愈加受到人們的重視和廣泛的應(yīng)用，目前已被應(yīng)用于病毒學(xué)、生殖生理、藥理學(xué)等研究。此外，雪貂對(duì)一些病毒性疫病具有獨(dú)特的敏感性，已被常規(guī)用于人類流感病毒性疾病如H1N1及其疫苗方面的研究，還有諸如麻疹、皰疹性口炎、阿留申病、牛鼻氣管炎及犬瘟熱等模型研究；另有報(bào)道證明雪貂適合毒理學(xué)試驗(yàn)，還可作為小腦發(fā)育不全動(dòng)物模型研究。近期，有文章報(bào)道雪貂可作為研究阻塞性呼吸道疾病的一個(gè)高度相關(guān)的模型[7]。王曉群等利用胚胎顯微注射和CRISPR/Cas9技術(shù)，成功對(duì)雪貂胚胎進(jìn)行基因編輯，得到了基因敲除雪貂，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示基因敲除雪貂與相關(guān)人類大腦疾病患者的表型十分相似，又為人類疾病的致病機(jī)理和治療手段的研究提供了新的疾病模型[7]。雪貂有大量的腦白質(zhì)和豐富的多腦回的特殊結(jié)構(gòu)，它們可能是一種用于研究創(chuàng)傷性腦損傷的人類相關(guān)因素的理想的小型哺乳動(dòng)物模型[8]。因此,分離和建立雪貂脂肪干細(xì)胞系，將會(huì)對(duì)干細(xì)胞的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用，進(jìn)一步進(jìn)行雪貂疾病模型的干細(xì)胞治療評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用雪貂來自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北方實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中【SCXK(京)2014-11】，雄性3只，雌性2只，24～36月齡，體重3～8 kg。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取材在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所【SYXK(京)2011-0022】。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為: BL17002。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

胎牛血清(Gibco)，DMEM(Gibco)，PBS(Gibco)，青、鏈霉素原液(Hyclone公司) Trypsin-EDTA(Gibco BRL公司)，I型膠原酶(Sigma 公司)，成骨、成軟骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基均來自于Cyagen公司，Lamnin-111(Stemcell)，F(xiàn)orskolin(Sigma公司)，IBMX(Sigtrm公司)，β-FGF(Stem Cell)，EGF(Stem Cell)，B27(STEM CELL)，油紅O(Amresco公司)；CD29-PE-cy7、CD45-Percp-cy5、CD90-FITC、CD105-APC 及CD11b-APC-Cy7 等單克隆流式抗體均為美國(guó) Pharmingen 公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

流式細(xì)胞儀(Aria Ⅱ，Becton Dickinson，美國(guó))，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems 7300，美國(guó))，電泳儀(北京六一儀器廠，中國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))，離心機(jī)(湘儀離心機(jī)有限公司，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 脂肪組織的提取與脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)

氯胺酮麻醉處死雪貂后剪毛,碘酊、乙醇消毒，在無菌條件下于腹部做十字切口，皮下游離至腹股溝，采取腹部和腹股溝處皮下脂肪，在無菌條件下把脂肪組織剪碎成0.5 mm2的組織塊，加入2倍體積容量的0.075%Ⅰ型膠原酶在37℃下振蕩消化1 h，進(jìn)行消化分離。經(jīng)70 μm細(xì)胞篩過濾，4℃下1500 r/min離心10 min，棄上清。紅細(xì)胞裂解液處理5 min，加入PBS，4℃下1500 r/min離心10 min，棄上清。以4000細(xì)胞/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中。48 h后首次換液，去除未貼壁細(xì)胞及殘留的紅細(xì)胞。此后每3 d換液，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，按1∶3 進(jìn)行傳代。

1.2.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

采用MTT法，取P3，P4，P5 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以 4000細(xì)胞/孔接種96孔板，分為4組，每組三個(gè)復(fù)孔，37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔 24 h 加入MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)孵育 4 h，終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)上清液。每孔加 150 μL DMSO，振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分融解。比色：選擇 490 nm 波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) ASCs表面特異性蛋白

取P3代脂肪干細(xì)胞，消化收集細(xì)胞，1000 r/min 離心5 min，2.5%FBS/PBS 溶液重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度為106細(xì)胞/mL，向各樣品管中分別加入標(biāo)記的抗體，冰上避光孵育30 min，PBS 清洗3次后，流式細(xì)胞儀分析ASCs表面特異性抗原。標(biāo)記的抗體有：CD29-PE-cy7、CD45-Percp-cy5、CD90-FITC、CD105-APC 及CD11b-APC-Cy7。

1.2.4 成脂分化及鑒定

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，以2×104細(xì)胞/cm2接種到6 孔培養(yǎng)板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50% ～70%，去除基質(zhì)培養(yǎng)基，加入2 mL 成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基A(Cyagen)繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液(Cyagen)1 d, 共誘導(dǎo)14～21 d，觀察誘導(dǎo)過程中細(xì)胞的形態(tài)變化，對(duì)照加入基質(zhì)培養(yǎng)基。油 紅O染色：吸去誘導(dǎo)液，用PBS洗2次；加入4%多聚甲醛固定30 min；吸去固定液，加入去離子水清洗1次，加入60%異丙醇清洗2次。加入油 紅O染色液，染色60 min； 用去離子水洗2次，去除殘留的染色液； 加入PBS，完成染色；顯微鏡下觀察,拍照。

1.2.5 成骨分化及鑒定

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，以2×104細(xì)胞/cm2接種到6 孔培養(yǎng)板中，24 h后更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Cyagen)，每3 d換液，誘導(dǎo)周期為21 d。茜素紅(Alizarin Red)染色: Tris-HCl配制0.1%茜素紅溶液，其pH值調(diào)為4.2。吸去誘導(dǎo)液，用PBS洗2次； 加入4%多聚甲醛固定30 min；吸去固定液，加入0.1%的茜素紅染色液，染色10 min；用PBS洗2次，去除殘留的染色液；加入PBS，完成染色；顯微鏡下觀察, 拍照。

1.2.6 3-D軟骨分化及鑒定

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，按2×106細(xì)胞/ mL放置于1.5 mL Ependorf 管中，蓋子用注射器針頭穿刺小孔，保持管內(nèi)能進(jìn)入氣體。離心后放置5% CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h加入0.5 mL成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(Cyagen)，每3 d換液1次。培養(yǎng)第21天用4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，阿利新藍(lán)染色，顯微鏡下觀察并拍照。阿利新藍(lán)染色：細(xì)胞球團(tuán)用PBS清洗, 4%多聚甲醛固定10 min，再用20%的葡萄糖孵化30 min，移入OCT包埋劑中室溫浸泡4 h，更換新的OCT包埋劑，室溫浸泡6 h，將標(biāo)本置于托物臺(tái)，用恒冷箱切片機(jī)切片，片厚10 μm，貼于預(yù)處理的載玻片上，-20℃冰箱保存。冷凍切片用阿利辛藍(lán)染色，反染色用核固紅。石蠟包埋切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.2.7 神經(jīng)分化及鑒定

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，以3×104細(xì)胞/cm2接種于經(jīng)Lamnin-111 包被處理的6孔板中，加入Neurobasal培養(yǎng)基(stem cell)，培養(yǎng)基內(nèi)添加了0.5 mmol/L IBMX，10 μmol/L Foskolin, β-FGF(20 ng/mL)、EGF(20 ng/mL)、2% B27。每3 d更換新鮮誘導(dǎo)液，每周換液2次，每7～8 d傳代1次。免疫熒光： ADSCs細(xì)胞以3000細(xì)胞 / cm2密度接種于預(yù)先用多聚賴氨酸包被處理的24孔板，孔中放置玻片,培養(yǎng)24 h后，加入神經(jīng)誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)6 d后進(jìn)行免疫熒光染色：先用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗1次，用0.5% Triton-X-100處理10 min，PBS洗1次，加入1% BSA封閉20 min，加一抗室溫孵育1 h， PBS洗3次，加熒光二抗，室溫孵育1 h，PBS洗3次。載玻片上先加1滴DAPI封片劑，將蓋玻片從24孔板中移至載玻片上，用指甲油密封，用激光共焦顯微鏡拍攝熒光圖像。

1.2.8 總RNA提取，cDNA合成和定量PCR分析

使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA)從細(xì)胞中提取總RNA，總RNA濃度由260 nm(OD260)的光學(xué)密度測(cè)定。用Super ScriptTMIII First-Strand Synthesis System(Thermo Fisher)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，-20℃?zhèn)溆谩?yīng)用SYBR? Premix Ex TaqTMII(Tli RNase H Plus)(Takara)反應(yīng)體系檢測(cè)相關(guān)基因如Nurr1、TH，每個(gè)樣品用2 μL cDNA，加入10 μL Taq Mans Gene Expression Assay kit, 6 μL 無 RNase/DNase水，25 μL 2x Taq Mans Μniversal PCR Master Mix (Applied Bio-systems),總反應(yīng)體系是 50 μL, GAPDH作內(nèi)參。數(shù)據(jù)分析采用供應(yīng)商提供的 ABI Prism 7000 Sequence Detection Systems version 1.0 軟件系統(tǒng)，每個(gè)樣本的Ct值用每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)來確定。每個(gè)目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平按照Taq Mans的管家基因GAPDH的Ct值來確定 (2△△Ct公式，Perkin Elmer 用戶手冊(cè) #2)。每個(gè)樣本一式三份進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的形態(tài)學(xué)觀察，生長(zhǎng)曲線，PCR干性基因檢測(cè)

新分離的細(xì)胞是多種異質(zhì)細(xì)胞的混合體，呈圓形，大小不一(圖1 A)，懸浮于基質(zhì)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后可見梭形貼壁細(xì)胞，48 h首次換液后可見貼壁細(xì)胞開始呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形，多角形，至72 h 細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞排列密集，呈集落生長(zhǎng)，約7 d細(xì)胞密度達(dá)80% ～90%。形態(tài)均一, 為長(zhǎng)梭形(圖1B), MTT測(cè)定生長(zhǎng)曲線第3代至5代結(jié)果顯示ADSCs增殖性能良好(圖2)。干細(xì)胞干性基因和細(xì)胞結(jié)構(gòu)關(guān)鍵基因PCR檢測(cè)結(jié)果(圖3)表明ADSCs表達(dá)干性基因Oct4，未表達(dá)胚胎干細(xì)胞的干性基因Nanog，Tert，Sox2；波形蛋白Vimentin負(fù)責(zé)維持細(xì)胞骨架的完整性，它對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化具有重要作用。細(xì)胞表達(dá)基因CD13、CD45、CD59、CD105、CD166，表明所得細(xì)胞群是一個(gè)含有脂肪干細(xì)胞(ADSCs)、周細(xì)胞(pericytes)及內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的混合體。

圖3 半定量PCR檢測(cè)干性基因結(jié)果(P1)Figure 3 Semi-quantitative PCR results for stemness genes (P1 cells)

圖1 雪貂分離與傳代后的細(xì)胞形態(tài)(P1)Figure 1 The morphology of passage 1 (P1) ferret ADSCs

圖2 ADSCs增殖曲線Figure 2 Proliferation curve of the ferret ADSCs

2.2 ADSCs的表面抗原特征

細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4)細(xì)胞均一性較好，第一代脂肪干細(xì)胞高度表達(dá)特征抗原CD90(53.1%)，CD105(93.7%)，CD29(99.6%)，低表達(dá)CD45(28.3%)，CD11b(36.3%)。結(jié)果表明分離獲得的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的基本特征。

2.3 誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)變化與特異性染色

成脂誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，3 d后顯微鏡下可見部分細(xì)胞胞質(zhì)中有細(xì)小的脂質(zhì)顆粒出現(xiàn)，由纖維狀細(xì)胞變成圓形細(xì)胞，并且細(xì)胞內(nèi)有多個(gè)圓形空泡；第6天起，細(xì)小的顆粒匯聚成較大的脂滴；12 d后，分化成多脂滴或單脂滴脂肪細(xì)胞，14 d后，80%的細(xì)胞內(nèi)充滿脂滴，細(xì)胞核被擠向邊緣，油紅O染色結(jié)果，顯示細(xì)胞中紅染顆粒為脂滴(圖5B)。細(xì)胞兩端的突起縮短，細(xì)胞逐漸變圓。隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加脂滴數(shù)量不斷增多，油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴呈紅色，對(duì)照組呈陰性(圖5A)。

2.4 茜素紅(Alizarn Red) 染色

更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，細(xì)胞生長(zhǎng)快速，呈現(xiàn)鱗片狀，并且連接成片，形成集落，隨后細(xì)胞呈多層生長(zhǎng)，胞質(zhì)中出現(xiàn)絲狀或顆粒狀物質(zhì)，胞外基質(zhì)也不斷增多，細(xì)胞表面鈣鹽沉積，誘導(dǎo)21 d后鏡下觀察，已無法分辨細(xì)胞形狀，表面出現(xiàn)較多類似結(jié)節(jié)狀的結(jié)構(gòu)，茜素紅染色后鏡下可見細(xì)胞密集處有深紅色沉著物，呈長(zhǎng)島嶼狀，并向四周放射，中心顏色明顯加深，對(duì)照組無著色鈣結(jié)節(jié)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞外散在出現(xiàn)鈣鹽沉積, 21 d可見細(xì)胞外有大量鈣結(jié)節(jié)出現(xiàn)(圖6)。

2.5 成軟骨分化

第三代的ASCs在成軟骨誘導(dǎo)3-D分化21 d后，石蠟包埋切片，阿利新藍(lán)染色可見藍(lán)色的軟骨膠原基質(zhì)(圖7)。

2.6 神經(jīng)分化

用神經(jīng)誘導(dǎo)液2 d后,細(xì)胞逐漸形成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)(圖8), 6 d后的免疫熒光結(jié)果顯示部分細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記Vimentin，神經(jīng)元樹突標(biāo)志物 Map2、NeuN(圖9)，定量PCR檢測(cè)到神經(jīng)元標(biāo)志基因TH、EN1、NURR1，以及CD44的升高(圖10)。

圖4 干性標(biāo)志物細(xì)胞表面分子CD11b、CD45、CD29、CD90、CD105的流式檢測(cè)結(jié)果Figure 4 FACS results for the stem stem cell surface markers CD11b, CD29, CD45, CD90, and CD105

圖5 脂肪樣細(xì)胞油紅O染色(×200)Figure 5 Adipocyte-like cells,oil O staining(×200)

圖6 成脂分化21 d后茜西紅染色(×200)Figure 6 Alizarin red staining after 21 d of adipogenic differentiation of the ADSCs (×200)

注：A為對(duì)照組；B為實(shí)驗(yàn)組，軟骨組織染成藍(lán)色。圖7 阿利新藍(lán)與蘇木素染色(×400)Note. A is for the control group. The experimental group is on the right (B) and cartilage dyed blue.Figure 7 Adipocyte-like cells,Alcian blue and hematoxylin staining(×400)

注：A為對(duì)照組，B為誘導(dǎo)3 d后。圖8 雪貂ADSCs神經(jīng)誘導(dǎo)分化對(duì)比Note. A.Control cells. B.3d after induction.Figure 8 Neural differentiation of ferret ADSCs

注：與對(duì)照組比較，* P< 0.05；與誘導(dǎo)組細(xì)胞比較，** P < 0.01。圖9 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CD44、TH、EN1、NURR1基因表達(dá)Note. Compared with the control group, * P < 0.05. Compared with the induced cell group, ** P < 0.01.Figure 9 Real-time quantitative PCR results of the stemness gene CD44 and TH, EN1, and NURR1 expression

注：A，Map2(綠色×400)；B，NeuN(綠色×400)；C，Vimentin(綠色×630)。圖10 雪貂神經(jīng)分化6 d后的免疫熒光Note. A is Map2 (green ×400). B is NeuN (green ×400). C is Vimentin (green ×630)Figure 10 Immunofluorescence detection of the ferret ADSCs following 6 d of neural differentiation

3 討論

雪貂作為新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，愈加受到科學(xué)家的重視。由于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)自體的干細(xì)胞移植，目前亦被認(rèn)為是最有希望和應(yīng)用前途的干細(xì)胞來源，它也是干細(xì)胞移植的理想的種子細(xì)胞。分離并鑒定雪貂脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，為人類疾病的動(dòng)物模型的干細(xì)胞治療提供同源性的干細(xì)胞，并對(duì)干細(xì)胞安全性、有效性評(píng)價(jià)提供依據(jù)具。此外，雪貂在病毒性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究及疫苗的開發(fā)應(yīng)用中可能具有重要價(jià)值。目前，分離和應(yīng)用雪貂的間充質(zhì)干細(xì)胞國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道，由于目前市場(chǎng)上尚沒有雪貂的專用抗體，我們采用了大鼠的抗體，結(jié)果表明大鼠的抗體與雪貂有同源性也有不同，比如CD11b與CD45在理論上應(yīng)該是陰性的即小于5%，而CD90僅僅表達(dá)了53.1%，理論上表達(dá)應(yīng)該在95%以上，但是整體陽性抗體的高表達(dá)與陰性抗體的低表達(dá)的基本趨勢(shì)符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)。成軟骨分化我們采用了較為先進(jìn)的3-D誘導(dǎo)方法即用細(xì)胞球進(jìn)行的成軟骨分化方法。最近的文獻(xiàn)報(bào)道顯示與傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，3-D 培養(yǎng)的細(xì)胞球在抗凋亡、多向分化、旁分泌、抗炎等多項(xiàng)生物功能上明顯增強(qiáng)，其機(jī)制與細(xì)胞骨架的改變、細(xì)胞接觸的增加和低氧微環(huán)境的刺激有關(guān)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)于難愈性創(chuàng)面的修復(fù)、缺血組織的修復(fù)、組織重塑具有顯著治療效果，有廣闊臨床應(yīng)用前景[9]。ASCS成神經(jīng)分化目前在大、小鼠中雖然有報(bào)道，但是尚未見雪貂脂肪干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的報(bào)道，我們也還需要對(duì)分化的神經(jīng)元做進(jìn)一步的細(xì)胞膜電位測(cè)試并證實(shí)其具有分泌功能性神經(jīng)元的功能。神經(jīng)分化培養(yǎng)液中采用的神經(jīng)誘導(dǎo)劑IBMX (3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)，是胞內(nèi)cAMP降解酶磷酸二酯酶(PDE) 的非特異性抑制劑, 它可以通過抑制細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷的降解而提高胞內(nèi)cAMP水平，而第二信使cAMP 對(duì)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞的多種功能有重要的作用，細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平增加有助于體外的細(xì)胞分化[10]。