徐德華 鄒先明 張偉

【摘要】 目的：檢測β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達情況及其與生存期的關(guān)聯(lián)性。方法：Envision法檢測資料完整的120例NSCLC中β-tubulin Ⅲ、ERCC-1的表達，所有病例均予以順鉑或紫杉醇為主的輔助聯(lián)合化療，隨訪生存期。結(jié)果：β-tubulin Ⅲ在NSCLC中的陽性表達率小于正常肺組織中，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。ERCC-1在NSCLC中的陽性表達率明顯大于正常肺組織（P<0.05）。β-tubulin Ⅲ、ERCC-1的表達和性別、年齡、組織學(xué)類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性（P>0.05），β-tubulin Ⅲ的表達與分化程度相關(guān)（P<0.05）。β-tubulin Ⅲ（-）、ERCC-1（-）生存期最長，β-tubulin Ⅲ（+）、ERCC-1（+）生存期最短。結(jié)論：β-tubulin Ⅲ可能參與介導(dǎo)肺癌的生長、侵襲。β-tubulin Ⅲ（-）、ERCC-1（-）的NSCLC患者可能從以順鉑或紫杉醇為主的輔助聯(lián)合化療中受益。

【關(guān)鍵詞】 β-tubulin Ⅲ； ERCC-1； 非小細胞肺癌； 陽性表達率

【Abstract】 Objective：To detect the expression and the relationship between expression and life of β-tubulin Ⅲ，

ERCC-1 in non-small cell lung cancer.Method：120 cases of NSCLC of expression of beta-tubulin Ⅲ and ERCC-1

were detected by the Envision method，and all cases were treated with cisplatin or paclitaxel based adjuvant chemotherapy，followed up for survival.Result：The positive expression rate of β-tubulin Ⅲ in non-small cell lung cancer was lower than that in normal lung tissue，but there was no significant difference （P>0.05）.The positive expression rate of ERCC-1 in non-small cell lung cancer was significantly higher than that in normal lung tissue （P<0.05）.There was no correlation between the expression of β-tubulinⅢ and ERCC-1 and sex，age，histological type，TNM staging and lymph node metastasis（P>0.05），the expression of β-tubulin Ⅲ was related to the degree of differentiation （P<0.05）.The survival time of β-tubulin Ⅲ（-） and ERCC-1（-） was the longest，and the survival time of β-tubulin Ⅲ（+） and ERCC-1（+） was the shortest.Conclusion：The β-tubulin Ⅲ may be involved in the growth and invasion of lung cancer.The β-tubulin Ⅲ（-） and ERCC-1（-） of patients with NSCLC may benefit from adjuvant chemotherapy based on cisplatin or paclitaxel.

【Key words】 β-tubulin Ⅲ； ERCC-1； Non-small cell lung cancer； Positive expression rate

First-authors address：Traditional Chinese Medicine Hospital of Huizhou City，Huizhou 516000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.20.006

肺癌是目前世界各地中最常見的惡性腫瘤之一，且死亡率增長最快，WHO肺癌居癌癥死因第一位，對人類生命健康造成嚴(yán)重威脅。其中綜合治療仍然是占比約80%的非小細胞性肺癌（NSCLC）的首選治療方式，化療占有重要地位，但5年生存率改善幅度低于5%。探究其化療效果欠佳的原因，主要為化療藥物耐藥，無法殺傷腫瘤細胞[1-3]。研究報道顯示，微管蛋白β-tubulin Ⅲ可能與紫杉醇耐藥有關(guān)，切除修復(fù)交叉互補基因1（ERCC-1）可能與鉑類耐藥有關(guān)[3]。本文采用回顧性研究，檢測120例非小細胞肺癌組織β-tubulin Ⅲ、ERCC-1表達情況及臨床病理特征，表達水平與生存期的相關(guān)性，為臨床提供依據(jù)，以更高制定科學(xué)合理的化療方案和預(yù)后評估手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2002年10月-2004年11月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院的120例非小細胞肺癌組織標(biāo)本，均經(jīng)電子支氣管鏡活檢、經(jīng)皮肺穿或外科手術(shù)切除，作為NSCLC組，所有病例均予以順鉑或紫杉醇為主的輔助聯(lián)合化療，術(shù)前未行放化療，術(shù)后均經(jīng)病理確診為非小細胞肺癌；排除重大系統(tǒng)嚴(yán)重疾病，并傳染性疾病，不可耐受化療者。其中男67例，女25例，年齡35～79歲，平均（56.3±12.3）歲；病理分型：65例鱗癌（高分化16例，中分化26例，低分化23例），55例腺癌（高分化18例，中分化21例，低分化16例）。另外取10例NSCLC患者的距腫瘤病變>10 cm的無癌細胞浸潤正常肺組織作為對照組，男8例，女2例。本研究已通過本院倫理委員會審批，患者均知情同意并簽署相關(guān)同意書。術(shù)后隨訪時間3～5年。

1.2 試劑 即用型β-tubulin抗體購自上海美吉生物公司，1∶200 ERCC-1抗體購自美國Amgen生物公司，Envision試劑盒購自美吉生物公司，兔抗人多克隆抗體購自美國Amgen生物公司。

1.3 實驗方法 檢測β-tubulin Ⅲ、ERCC-1表達情況：采用免疫組化染色（Envision法）。石蠟切片脫蠟和水化后，用pH 7.4的PBS沖洗，3 min/次，共3次，使用微波爐修復(fù)組織抗原，每張切片上滴加

1滴或50 μL 3%H2O2溶液于室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗，3 min/次，共3次，甩去PBS液，每張切片上滴加1滴或50 μL的第一抗，于室溫孵育60 min。PBS沖洗，3 min/次，共

5次，甩去PBS液，每張切片上滴加1滴或50 μL聚合物增強劑（試劑A），于室溫孵育，20 min。PBS沖洗，3 min/次，共3次，甩去PBS液，每張切片加1滴或50 μL酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物（試劑B），在室溫下孵育30 min，PBS沖洗，3 min/次，共3次，甩去PBS液，每張切片上加2滴或100 μL新鮮配制的DAB后，于顯微鏡下觀察3～10 min，若顏色為紅或棕色，為陽性。然后用蒸餾水沖洗，添加蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，用自來水沖洗，PBS沖洗返藍。將梯度的酒精脫水干燥，中性樹膠封片。以PBS為陰性對照，病理科已有的β-tubulin、ERCC-1陽性染色的肺癌石蠟切片為陽性對照。

1.4 免疫組化結(jié)果判讀

1.4.1 β-tubulin Ⅲ表達 瘤細胞胞漿內(nèi)（包括瘤細胞核周）出現(xiàn)清晰的黃色著色顆粒為陽性。并根據(jù)陽性腫瘤細胞的占比分為五等級：（1）0分為陽性細胞<5%；（2）1分為5%≤陽性細胞≤25%；（3）2分為26%≤陽性細胞≤50%；（4）3分為51%≤陽性細胞≤75%；（5）4分為陽性細胞>75%[3]。另外染色強度評分：0分為無色；1分為淡黃；2分為棕黃；

3分為棕褐。陽性細胞分值×染色強度分值=總分，當(dāng)總分為9～12分時為強陽性（+++），6～8分時為陽性（++），3～5分時為弱陽性（+），1～2分時為可疑（±），0分時為陰性（-），其中（-）和（±）為陰性表達[4]。

1.4.2 ERCC-1表達 當(dāng)細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，按陽性細胞占比及染色強度進行評估，陽性細胞≥75%為強陽性（+++），50%≤陽性細胞≤74%為陽性（++），25%≤陽性細胞≤49%為弱陽性（+），陽性細胞<25%為陰性（-）[5]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗或Fisher精確檢驗，使用單因素生存分析，采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗。當(dāng)P<0.05時表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在NSCLC和正常肺組織中的表達 β-tubulin Ⅲ在NSCLC細胞漿內(nèi)陽性表達率為73.3%（88/120）；低分化癌中大部分以陰性和弱陽性表達，黃染大部分較淺。β-tubulin Ⅲ

在正常肺組織中陽性表達率為100%（10/10），β-tubulin Ⅲ在NSCLC的陽性表達率小于正常肺組織，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。ERCC-1在NSCLC細胞核內(nèi)陽性表達率為40.0%（48/120），其中8例為強陽性；ERCC-1在正常肺組織中ERCC-1陽性表達率為0，即全陰表達；ERCC-1在NSCLC的陽性表達率明顯大于正常肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（字2=6.335，P<0.05）。見表1和圖1、2。

2.2 β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在NSCLC中的表達情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在NSCLC中的表達與性別、年齡、組織學(xué)類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無顯著相關(guān)性（P>0.05），β-tubulin Ⅲ在NSCLC中的表達與分化程度顯著相關(guān)（P<0.05），ERCC-1在NSCLC中的表達與分化程度相關(guān)性（P>0.05），見表2。

2.3 β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在NSCLC中的共同表達和生存期的關(guān)系 在120例NSCLC中，中位生存期

<5年的：β-tubulin Ⅲ（-）、ERCC-1（-）15例（12.5%），β-tubulin Ⅲ（+）、ERCC-1（-）41例（34.2%），β-tubulin Ⅲ（-）、ERCC-1（+）37例（30.8%），β-tubulin Ⅲ（+）、ERCC-1（+）27例（22.5%）。

3 討論

相關(guān)研究顯示，細胞骨架蛋白的異常表達及分布可能與腫瘤化生中細胞病理表型及病理生理過程相關(guān)[6-7]，其中β-tubulinⅢ表達在細胞漿內(nèi)，ERCC-1表達在細胞核內(nèi)。本研究結(jié)果顯示，β-tubulinⅢ在NSCLC中的表達低于正常肺組織，低分化癌中大部分以陰性和弱陽性表達，β-tubulinⅢ在正常肺組織中全陽性表達。這提示，β-tubulinⅢ的表達下調(diào)可能與肺癌的生長、侵襲有關(guān)，可能是包含MDR基因在內(nèi)的癌細胞基因突變，改變了內(nèi)部核酸序列及酶，使β-tubulin在NSCLC中的表達情況與正常組織有異[8-12]；并且β-tubulinⅢ具有一定的生理保護作用，可防御化學(xué)致癌物及毒素[13-15]；β-tubulinⅢ的表達與組織學(xué)類型無關(guān)，提示β-tubulinⅢ與臨床分期無關(guān)，不是惡變的特征，腫瘤的浸潤程度不能代表耐藥性的差異[16]。

目前，臨床認(rèn)為β-tubulin是多種化療藥物的作用靶點，其中包括紫杉類，而紫杉類耐藥主要是因為β-tubulin過度表達。因此，臨床上晚期NSCLC仍以含鉑方案化療為主。順鉑主要通過與細胞DNA雙鏈耦合形成加合物或形成鏈間交叉連接，抑制DNA復(fù)制，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。順鉑耐藥機制包括減少細胞毒的鉑-DNA復(fù)合物形成，以及鉑-DNA復(fù)合物形成后防止細胞死亡[17]，為內(nèi)源性或獲得性耐藥。而ERCC-1是核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)（NER）中DNA損傷識別和鏈間切割的關(guān)鍵成分[18]。而NER存在于大腸桿菌中，是修復(fù)DNA損傷的重要途徑，包含XPC-HHRAD23、XPA、RPA、DNA連接酶等基因，其中ERCC-1為損傷堿基5′-3′的切割酶，尤其重要，可識別損傷DNA5′，缺失ERCC-1的細胞組織無法修復(fù)順鉑所致的DNA損傷[19-20]。

目前多數(shù)報道表明，ERCC-1與臨床療效多為負(fù)性相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，β-tubulin、ERCC-1在NSCLC中的表達與性別、年齡無關(guān)，在中-高分化肺癌中表達大于低分化。這提示，肺癌耐藥的發(fā)生與性別、年齡無關(guān)，低分化的肺癌在對抗癌藥物的耐藥性，其耐藥性會下降，與臨床的化療敏感現(xiàn)象相符。

綜上所述，β-tubulinⅢ可能參與介導(dǎo)肺癌的生長、侵襲，β-tubulinⅢ（-）、ERCC-1（-）的NSCLC患者可能從以順鉑或紫杉醇為主的輔助聯(lián)合化療中受益。

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（收稿日期：2018-04-08） （本文編輯：張爽）