唐詩慧，張 麗，方步武

（天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系，天津300070）

肝纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的動態(tài)進(jìn)行性過程，是由多種慢性肝病共同作用的結(jié)果，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)不斷上升的趨勢[1]。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化并增殖，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成與降解失衡并最終導(dǎo)致肝纖維化[2]。轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β1） 是介導(dǎo)肝纖維化最重要的細(xì)胞因子，與細(xì)胞外基質(zhì)的代謝和肝纖維化的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[3]。TGF-β1對HSCs的激活、增殖、轉(zhuǎn)化具有極其重要的意義，是最強(qiáng)的促纖維化細(xì)胞因子[4]。本實(shí)驗(yàn)采用的蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方是由青蒿、鱉甲、知母、白花蛇舌草、虎杖、大黃等九味中藥組成，此中藥復(fù)方配伍有良好的益氣活血、清熱利濕、軟堅(jiān)散結(jié)功效，對治療慢性肝病、肝纖維化有良好的療效[5]。本課題組前期工作已證明蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方先水后醇（60%）提取方案對LX-2細(xì)胞具有良好的抑制作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)方提取工藝。以TGF-β1刺激LX-2細(xì)胞，給予蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方治療，初步探討進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝后的蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對LX-2細(xì)胞的影響，旨在揭示蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方抗纖維化的藥物作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株LX-2細(xì)胞株由北京地壇醫(yī)院提供。

1.1.2 主要試劑 Recombinant Human TGF-beta1-Mammalian購于美國PeproTech公司，產(chǎn)品編號100-21-10。Anti-α-Smooth Muscle Actin antibody購于美國Cell Signaling Technology公司，產(chǎn)品編號19245T。Rabbit Anti-Collagen I antibody購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號：bs-0578R。BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）購于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品編號：P10010。Anti-β-actin、山羊抗兔抗體、LDH試劑盒以及ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。DMEM以及胎牛血清均購于美國Gibco公司。

1.1.3 主要儀器 680酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國 NAPCO series5400），DL-CJ-2NDI潔凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司），WD-9405A型脫色搖床（北京六一儀器廠），湘儀L420低速自動平衡離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司），垂直電泳槽（美國BIO-RAD公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 從液氮中取出細(xì)胞并復(fù)蘇，將細(xì)胞置于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞密度長至培養(yǎng)瓶底90%時，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入1 mL 0.25%胰酶，消化1 min，離心后按照1:3的比例進(jìn)行傳代，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)分成5組，分別為（1）control組：細(xì)胞對照組；（2）TGF-β1 刺激組（2 ng/mL），作用24 h；（3）不同濃度蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方處理組（0.5、1、2 mg/mL），作用 24 h。

1.2.2 復(fù)方提取 將鱉甲、青蒿、地黃等九味中藥按照特定比例稱取，復(fù)方總重141.6 g。先將鱉甲用840 mL三蒸水在微沸狀態(tài)下回流提取2 h，加入其它剩余藥材浸泡2 h，然后在微沸狀態(tài)下再回流提取1 h，收集水提取液。840 mL的95%乙醇繼續(xù)回流提取2次，每次0.5 h，收集醇提取液，并與水提取液混合后旋蒸濃縮，濃縮液冷凍干燥至恒重，備用。

1.2.3 MTT比色法檢測LX-2細(xì)胞增殖情況 取處于對數(shù)期的LX-2細(xì)胞接種于96孔板中，根據(jù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計分別對每組細(xì)胞進(jìn)行處理，每組設(shè)5個副孔。24 h后，每孔加入20 μL MTT，混勻后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入20 μL DMSO，振蕩10 min，在490 nm處測定各孔吸光度值（A值），計算細(xì)胞抑制率（inhibition rate,IR）。抑制率計算公式：抑制率（%）=［（對照組吸光度值-實(shí)驗(yàn)組吸光度值）/對照組吸光度值］×100%。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)液中Hyp含量測定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計處理后，收集96孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液?？瞻坠苤屑尤?.5 mL雙蒸水，標(biāo)準(zhǔn)管中加入0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)液，每個測定管中加入0.5 mL的待測樣本，所有管中加入0.05 mL的消化液，混勻，37℃水浴3h。所有管加入試劑盒中試劑一0.5mL室溫靜置10min，試劑二0.5 mL室溫靜置5 min，試劑三1 mL 60℃水浴15 min，流水冷卻后3 500 r/min，離心10 min，取上清在550 nm處測定各管吸光度。羥脯氨酸含量（μg/mL）=（測定OD值-空白OD值/標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（5 μg/mL）×樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性測定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液備用。按照碧云天生物研究所乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。LDH活性=（樣品孔吸光度－背景空白對照孔吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mU/mL）。

1.2.6 Western blot法檢測 collagen Ι、α-SMA 蛋白的表達(dá) 取對數(shù)期細(xì)胞以5×104個/mL單個細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔2 mL。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計處理后，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，每孔加入80μLRIPA蛋白裂解液，冰浴條件下使其充分裂解提取細(xì)胞總蛋白并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后取20 μg蛋白上樣，8%SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF上，室溫條件下5%的脫脂奶粉封閉2 h。4 ℃下?lián)u床孵育一抗（collagen Ι 1∶500、α-SMA 1∶1000）過夜。次日，TBST洗膜3次，每次5min，室溫下孵育二抗2 h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，采用Image J軟件對蛋白條帶的光密度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對LX-2細(xì)胞增殖的影響 與對照組相比，2 ng/mL的TGF-β1作用于細(xì)胞24 h，細(xì)胞明顯增殖（P＜0.05）。與 TGF-β1刺激組相比，不同濃度的蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方（藥物終濃度為0.5、1、2 mg/mL）作用24 h后，對LX-2細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用（P＜0.05），且隨著濃度增大，抑制作用越明顯，表現(xiàn)出一定程度的劑量依賴性（表1）。

表1 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對LX-2細(xì)胞增殖的影響(±s，n=5)Tab 1 Effects of HBYYRJF on the proliferation of LX-2 cells(±s，n=5)

表1 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對LX-2細(xì)胞增殖的影響(±s，n=5)Tab 1 Effects of HBYYRJF on the proliferation of LX-2 cells(±s，n=5)

與對照組比較，*P＜0.01；與 TGF-β1 處理組比較，#P＜0.05；與HBYYRJ（0.5 mg/mL）組比較，ΔP＜0.05；與 HBYYRJ（1 mg/mL）組比較，◇P＜0.05

組別/(mg/mL)對照組TGF-β1刺激組HBYYRJ 0.5 HBYYRJ1 HBYYRJ 2抑制率/%--15.59±0.97*21.11±0.86*#33.15±1.54#Δ 49.611±1.86#Δ◇

2.2 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性的影響 不同濃度的蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方作用于LX-2細(xì)胞24 h后，與對照組相比，上清中LDH活性無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2、圖 1）。

表2 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對細(xì)胞上清中LDH活性的影響(±s，n=3)Tab 2 Effects of HBYYRJ on the activity of LDH(±s，n=3)

表2 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對細(xì)胞上清中LDH活性的影響(±s，n=3)Tab 2 Effects of HBYYRJ on the activity of LDH(±s，n=3)

與對照組比較，*P＞0.05

組別/(mg/mL)對照組HBYYRJ 0.5 HBYYRJ 1 HBYYRJ 2 LDH活性/mU/mL 0.09±0.009 0.095±0.015*0.103±0.019*0.101±0.018*

圖1 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對細(xì)胞上清中LDH活性的影響（±s，n=3）Fig 1 Effects of HBYYRJ on the activity of LDH（±s，n=3）

2.3 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對細(xì)胞培養(yǎng)液Hyp含量的影響 不同濃度蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方作用于LX-2細(xì)胞24 h后，與模型組相比，各劑量組細(xì)胞上清液中羥脯氨酸含量明顯降低，且劑量越大，羥脯氨酸含量越低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3、圖2）。

表3 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對Hyp含量的影響(±s，n=3)Tab 3 Effects of HBYYRJ on the content of Hyp(±s，n=3)

表3 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對Hyp含量的影響(±s，n=3)Tab 3 Effects of HBYYRJ on the content of Hyp(±s，n=3)

與對照組比較，*P＜0.01；與 TGF-β1 刺激組比較，#P＜0.05

組別/(mg/mL)對照組TGF-β1刺激組HBYYRJ 0.5 HBYYRJ 1 HBYYRJ 2 Hyp(μg/mL)1.34±0.15 2.10±0.31*1.69±0.13#1.56±0.14#1.50±0.18#

圖2 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對Hyp含量的影響（±s，n=3）Fig 2 Effects of HBYYRJ on the content of Hyp（±s，n=3）

2.4 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對collagen Ι和α-SMA蛋白水平的影響 見圖3、4。

圖3 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對LX-2細(xì)胞collagenΙ表達(dá)的影響（±s，n=3）Fig 3 Effects of HBYYRJ on the expression level of collagen Ι（±s，n=3）

圖4 蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對LX-2細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響（±s，n=3）Fig 4 EffectsofHBYYRJontheexpressionlevelof α-SMA（±s，n=3）

3 討論

肝纖維化大多發(fā)生在各種慢性肝損傷后，是肝臟對于各種慢性刺激損傷進(jìn)行自我修復(fù)的病理過程。肝纖維化的過程是可逆的，但如果不控制肝纖維化任其發(fā)展，將會形成肝纖維結(jié)節(jié)及肝臟結(jié)構(gòu)和功能異常，最終導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌[6]。肝纖維化發(fā)生最為關(guān)鍵的一步是HSC的活化和增殖[7]。TGF-β1是目前已知最強(qiáng)的促肝纖維化細(xì)胞因子[8]。HSCs在TGF-β1的作用下活化增殖，并且促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ型膠原和Ⅳ型膠原的產(chǎn)生進(jìn)而使得肝纖維化進(jìn)一步發(fā)生發(fā)展[9]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方能顯著抑制LX-2細(xì)胞的增殖，表明蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方可通過抑制LX-2細(xì)胞增殖發(fā)揮抗纖維化的作用。羥脯氨酸是膠原蛋白中特有的有效成分，肝纖維化時，活化的HSCs合成大量以膠原纖維為主的細(xì)胞外基質(zhì)，測定培養(yǎng)液上清中羥脯氨酸含量可換算成HSCs產(chǎn)生膠原蛋白的含量，以反映肝纖維化的程度[10]。蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方能顯著降低羥脯氨酸含量。α-SMA是HSCs活化的標(biāo)志，在肝纖維化研究中被廣泛應(yīng)用，α-SMA的表達(dá)隨著肝纖維化的加重而增加[11]。本實(shí)驗(yàn)通過測定LX-2細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)來反映肝纖維化的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方降低α-SMA蛋白水平，表明蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方能抑制LX-2細(xì)胞活化，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

中藥在治療肝纖維化方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢，中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)正好應(yīng)對肝纖維化復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制。蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方主要是由鱉甲、青蒿、地黃等九味中藥構(gòu)成，具有多種藥理作用。本實(shí)驗(yàn)探究蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方對LX-2細(xì)胞增殖，細(xì)胞產(chǎn)生羥脯氨酸含量以及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方具有良好的抗肝纖維化作用。

本研究結(jié)果顯示，蒿鱉養(yǎng)陰軟堅(jiān)方通過抑制HSCs的激活增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積減輕TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化，為臨床治療肝纖維化提供了新的理論依據(jù)。