錢興運，郎娟娟，陶若琳，吳春暖，王 晨

（天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院藥學部，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津300060）

多西他賽（docetaxel,DTX）是治療非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）最有效的藥物之一[1]，其能通過在腫瘤細胞有絲分裂期間形成無功能的微管束來抑制肺癌細胞的增殖[2]。DTX聯(lián)合鉑類藥物的治療方案是治療晚期NSCLC的一線治療方案[3]，在許多國家DTX也被批準單獨作為二線治療藥物用于晚期NSCLC的治療[4]。盡管DTX在NSCLC的治療中扮演著重要角色，但是DTX同時也會產生諸如竇性心動過緩等多種心臟毒副作用[5]。

左卡尼?。↙-carnitine,L-CNT）是一種內源性氨基酸，對哺乳動物的能量代謝至關重要。已有研究表明L-CNT及其衍生物能夠阻止ROS的形成，清除自由基，并防止細胞發(fā)生氧化應激[6]。近年來，很多研究也表明L-CNT在應對化療藥物引起的心臟毒性和周圍神經毒性方面有一定作用[7]。還有研究表明，L-CNT能夠抑制表柔比星等藥物在肺腺癌中的抗腫瘤作用[8-9]，然而在胃癌細胞中，L-CNT卻能增強5-氟尿嘧啶的抗腫瘤作用[10]。因此，L-CNT對不同化療藥物在不同腫瘤細胞中的影響是不同的。因此，本實驗旨在研究聯(lián)合給藥時，L-CNT對DTX抑制人肺癌細胞NCI-H520增殖作用的影響，并初步探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系 人肺癌NCI-H520細胞（天津腫瘤研究所生物技術實驗室）。

1.2 儀器和試劑 細胞恒溫培養(yǎng)箱；IX70倒置光學顯微鏡；FACS流式細胞儀；左卡尼汀注射液；多西他賽注射液；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒；兔抗人Bcl-2，Bax，P21和 P53抗體；四甲基偶氮唑藍（MTT）；PI粉末；RNA 酶（RNase A）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將從液氮中取出的NCI-H520細胞復蘇后，接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，待細胞生長密度達到培養(yǎng)皿的80%左右時，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，待細胞收縮變圓時，用培養(yǎng)液終止消化，進行傳代或稀釋成合適濃度進行實驗。

1.3.2 實驗分組 對照組：未被藥物處理過的細胞；L-CNT 組：只加 L-CNT（80 μg·mL-1）作用 24 h的細胞；DTX 組：只加 DTX（40 μg·mL-1）作用 24 h的細胞；聯(lián)合用藥組：同時加入 L-CNT（80 μg·mL-1）和 DTX（40 μg·mL-1）作用 24 h 的細胞。每項實驗獨立平行重復3次。

1.3.3 不同濃度的DTX對NCI-H520細胞增殖的影響 將終濃度為6×104個·mL-1的細胞懸液接種于96孔板中，每孔100 μL，恒溫培養(yǎng)24 h。分別設空白對照組，陰性對照組和不同濃度的藥物實驗組，每組設5個復孔?？瞻讓φ战M只加培養(yǎng)液，陰性對照組為培養(yǎng)液和細胞，藥物試驗組為包含不同濃度DTX的培養(yǎng)液和NCI-H520細胞。待細胞貼壁后，將原培養(yǎng)液吸出，采用逐級稀釋的方法，將藥物終濃度稀釋成 0.25、2.5、5、10、25、50、100、200 μg·mL-1，每孔加入體積為200 μL的含藥培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，每孔加入 20 μL MTT 溶液（5 mg·mL-1），恒溫孵育4 h，棄掉孔內液體，每孔加入150 μL的DMSO溶液，低速震蕩15 min，在490 nm波長處測定吸光度，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件計算24 h的IC50值（40 μg·mL-1）作為后續(xù)實驗的 DTX 濃度。

1.3.4 MTT實驗 以 6×104個·mL-1的終濃度將NCI-H520細胞懸液接種于96孔板中，每孔100 μL，恒溫培養(yǎng)24 h。根據(jù)“1.3.3”的實驗結果，最終選用DTX 的濃度為其 IC50值（40 μg·mL-1），根據(jù)臨床給藥后的血藥濃度，確定L-CNT的濃度為80 μg·mL-1，實驗分組如“1.3.2”所述，并且每個組設置6個復孔，其余實驗步驟同“1.3.3”。

1.3.5 細胞凋亡 實驗以1×105個·mL-1的終濃度將NCI-H520細胞懸液接種于6孔板中，待貼壁后，每孔加入終體積為2 mL的含藥培養(yǎng)液。實驗分組同“1.3.2”，藥物濃度如“1.3.4”所述。恒溫培養(yǎng)24 h后，收集細胞懸液，用預冷的PBS洗滌細胞兩次，1 200 r·min-1離心 5 min，棄上清，100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，每管加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染料，避光條件下，4℃固定 30 min后，采用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.3.6 細胞周期 實驗以1×105個·mL-1的終濃度將NCI-H520細胞懸液接種于6孔板中，待貼壁后，每孔加入終體積為2 mL的含藥培養(yǎng)液。實驗分組同“1.3.2”，藥物濃度如“1.3.4”所述。恒溫培養(yǎng)24 h后，收集細胞懸液，用預冷的PBS洗滌細胞兩次，用75%的乙醇重懸細胞，4℃過夜。1 500 r·min-1離心5 min，棄掉上清，并用PBS洗滌1次，用200 μL PBS重懸細胞，每管加10 mg·mL-1PI染料1 μL和10 mg·mL-1RNase A 溶液 1 μL，避光條件下，4℃固定30 min后，采用流式細胞儀測定周期。

1.3.7 蛋白質免疫印跡實驗 以1×105個·mL-1的終濃度將NCI-H520細胞懸液接種于6孔板中，待貼壁后，每孔加入終體積為2 mL的含藥培養(yǎng)液。實驗分組同“1.3.2”，藥物濃度如“1.3.4”所述。收集細胞懸液，使用SDS裂解液提取總蛋白，測定蛋白濃度，并確定上樣體積。配制12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），每組上樣量為 20μg，采用80 V恒壓電泳，200 mA恒流轉膜，5%脫脂奶粉封閉 1 h。一抗 P21（1∶1 000），P53（1∶1 000），BAX（1∶1 000），BCL-2（1∶1 000），內參 β-actin（1∶2 000），4 ℃搖床過夜。二抗 P21（1∶2 000），P53（1 ∶2 000），BAX（1∶2 000），BCL-2（1∶2 000），內參β-actin（1∶4 000），搖床室溫孵育 1 h，在暗室用化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色曝光。將曝光結果進行灰度分析，比較各組目標蛋白表達量的變化。

1.4 統(tǒng)計學分析 本實驗采用GraphPad Prim 5和SPSS來對實驗數(shù)據(jù)進行分析，所有實驗獨立重復進行3次，實驗結果以±s的形式表示，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗進行分析，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為結果具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 L-CNT能夠增強DTX對NCI-H520細胞增殖的抑制作用 MTT的結果表明，DTX對NCI-H520細胞的抑制作用具有濃度依賴性，隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強（圖1F）。在顯微鏡下觀察各組細胞生長情況，對照組和L-CNT細胞組細胞貼壁狀態(tài)良好，細胞密度大，胞膜完整，細胞間連接緊密（圖1A和1B）；DTX組細胞密度降低（圖1 C）；聯(lián)合用藥組細胞密度進一步降低，細胞間隙變大（圖1 D）。MTT結果顯示，L-CNT對NCI-H520細胞的增殖無明顯影響，與L-CNT單藥組相比，L-CNT+DTX組細胞增殖率顯著降低，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；DTX能夠抑制NCI-H520細胞的增殖（P＜0.05）；與DTX單藥組相比，L-CNT+DTX組的細胞增殖率進一步降低，且具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（圖1 E）。結果表明，L-CNT能夠增強DTX對NCI-H520細胞增殖的抑制作用。

2.2 DTX在24 h不誘導細胞發(fā)生凋亡 細胞凋亡的結果顯示，24 h時，L-CNT組，DTX組和L-CNT+DTX組的細胞凋亡率與對照組相比，無統(tǒng)計學差異（圖2 A和2B），結果表明，L-CNT，DTX以及聯(lián)合用藥在24 h均不誘導NCI-H520細胞發(fā)生凋亡，結合“2.1”的實驗結果，表明DTX對NCI-H520細胞在24 h主要表現(xiàn)為抑制增殖的藥理作用。

2.3 L-CNT能夠增強DTX誘導的G2/M期阻滯 細胞周期的結果顯示，L-CNT對細胞周期沒有顯著影響，與L-CNT組相比，L-CNT+DTX組G2/M期細胞的比顯著升高，G1/G0期細胞顯著減少，均具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；DTX能夠誘導細胞發(fā)生G2/M期阻滯（P＜0.01）；與 DTX 組相比，L-CNT+DTX 組 G2/M期細胞比例進一步升高，G1/G0期細胞比例降低，且均具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。結果表明，L-CNT能夠增強DTX誘導的G2/M期阻滯（圖3）。

2.4 L-CNT能增加P21和P53蛋白的表達 Western blot結果顯示，同L-CNT組相比，L-CNT+DTX組細胞周期相關蛋白P21和P53的表達明顯增高（P＜0.05）；DTX能夠誘導P21和P53蛋白表達升高（P＜0.05）；同DTX組相比，L-CNT+DTX組P21和P53蛋白的表達量進一步增高（P＜0.05）。而各實驗組凋亡相關蛋白BAX和BCL-2的表達量沒有發(fā)生變化（圖4），說明L-CNT增強DTX抑制NCI-H520細胞增殖的能力可能是通過增強周期相關蛋白P21和P53的表達來實現(xiàn)的。

圖1 L-CNT和DTX單藥以及聯(lián)合用藥對NCI-H520細胞增殖的作用Fig 1 The effects of L-CNT,DTX or combination drugs on NCI-H520 cell proliferation

圖2 L-CNT和DTX單藥以及聯(lián)合用藥對NCI-H520細胞凋亡的影響Fig 2 The effects of L-CNT,DTX or combination drugs on NCI-H520 cell apoptosis

圖3 L-CNT和DTX單藥以及聯(lián)合用藥對NCI-H520細胞周期的影響Fig 3 The effects of L-CNT,DTX or combination drugs on NCI-H520 cell cycle

圖4 L-CNT和DTX單藥以及聯(lián)合用藥對NCI-H520細胞蛋白表達的影響Fig 4 The effects of L-CNT,DTX or combination drugs on the expression of proteins in NCI-H520 cells

3 討論

DTX屬于第二代紫杉烷類抗腫瘤藥物，其能通過在腫瘤細胞有絲分裂期間，增強微管蛋白的聚合作用并抑制其解聚，進而形成無功能的微管束，將腫瘤細胞增殖阻滯于G2/M期來抑制肺癌細胞的增殖。L-CNT及其衍生物能夠阻止ROS的形成，清除自由基，并防止細胞發(fā)生氧化應激，從而發(fā)揮細胞保護作用。

細胞周期受多種細胞通路調控，其中P53-P21通路發(fā)揮重要作用。P53是一種重要的腫瘤抑制基因[11]，參與誘導細胞周期阻滯，進行DNA修復等以響應各種細胞應激反應，包括DNA損傷，致癌應激，端粒功能障礙和缺氧等[12-13]。在細胞周期的調節(jié)中，P53主要負責監(jiān)測G0/G1和G2/M期的修正點，以起到調節(jié)周期的作用[14]。此外，它還能調節(jié)下游P21基因的表達[15]，并在細胞增殖中起重要作用。P21是P53的下游基因，其編碼的P21Cip/Wafl蛋白是具有廣泛激酶抑制活性的細胞周期抑制蛋白。P21Cip/Wafl與cyclinD，CyclinE和CDK2一起在細胞周期抑制中發(fā)揮作用[16-18]，P21的表達能夠誘導G1期，G2/M期或S期阻滯[19]，進而發(fā)揮抑制細胞增殖的效應。

由本實驗的結果，我們觀察到，DTX與L-CNT聯(lián)合應用后，周期相關蛋白P53與P21表達升高，細胞G2/M期阻滯增強。這可能是L-CNT的加入，使NCI-H520細胞中P53的蛋白表達量增加，進而誘導下游的P21蛋白表達升高，激活P53-P21通路發(fā)揮細胞周期抑制作用；有研究表明，DTX誘導細胞凋亡的發(fā)生晚于其誘導的細胞周期阻滯[20]，本研究的結果也表明DTX在NCI-H520細胞中的抗腫瘤作用，在24 h時，只表現(xiàn)為對細胞增殖的抑制作用，而不誘導細胞發(fā)生凋亡，因此，關于L-CNT對DTX誘導的細胞凋亡的影響還有待進一步研究。此外，本文只針對L-CNT和DTX同時給藥24 h進行了研究，而對于L-CNT和DTX的給藥順序是否會對其作用產生影響，仍有待于進一步研究。腫瘤病理錯綜復雜，不同病理分型的腫瘤對于化療藥物的敏感性不同，而L-CNT與不同的化療藥物聯(lián)合應用所產生的相互作用也不盡相同，因此，在使用左卡尼汀預防或降低心臟毒性的同時，如何更合理地與抗腫瘤藥物聯(lián)合應用，值得進一步研究。