于 洋 ，曹際森 ，王多偉 ，戚 峰

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普通外科，天津300052；2.天津港口醫(yī)院外科，天津300456；3.天津市第三中心醫(yī)院肝膽外科,天津300170）

研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞負(fù)責(zé)維持體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受[1]，隨著對(duì)其功能研究的不斷深入，相關(guān)人員已將其應(yīng)用于抑制器官移植的免疫耐受。近年來(lái)相關(guān)研究表明miRNA通過(guò)調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達(dá)影響免疫系統(tǒng)的發(fā)育及功能[2]，其中miR-146a是目前研究較為廣泛的miRNA之一，它在不同物種間的序列高度保守，并且在器官移植免疫排斥過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[3]。大量研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在Treg細(xì)胞的抑制功能的發(fā)揮上起著重要的調(diào)控作用[4-5]。在此基礎(chǔ)上，本研究的主要目的是探討Treg細(xì)胞體內(nèi)回輸對(duì)小鼠心臟移植免疫排斥反應(yīng)的影響以及進(jìn)一步調(diào)控miR-146a的表達(dá)對(duì)Treg細(xì)胞抑制功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)選用6～8周齡雄性C57，Balb/c小鼠（購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量20～25 g)，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Treg細(xì)胞的分選及體外擴(kuò)增 無(wú)菌條件下獲取及處理脾臟，加入PBS制備脾單細(xì)胞懸液，單細(xì)胞懸液白細(xì)胞計(jì)數(shù)，用PBS調(diào)整細(xì)胞密度為1×106，流式標(biāo)本的制備后立刻上機(jī)分選CD4+CD25+Treg細(xì)胞，采用德國(guó)美天旎公司的Treg細(xì)胞體外擴(kuò)增試劑盒按說(shuō)明書完成CD4+CD25+Treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增。

1.2.2 Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)染 對(duì)擴(kuò)增之后的Treg細(xì)胞采用廣州銳博公司的miR-146a agomir和miR-146a antagomir試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別實(shí)現(xiàn)對(duì)Treg細(xì)胞miR-146a表達(dá)水平的上調(diào)和下調(diào)。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：用完全1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并檢測(cè)細(xì)胞活力。然后用完全培養(yǎng)基按3×105/mL的密度接種在24孔板中。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30min。分別在相應(yīng)孔中加入100nmol/L agomir及150 nmol/L antagomir對(duì)Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)染，之后置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 d后進(jìn)行下一步檢測(cè)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR） 采用RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后調(diào)節(jié)T細(xì)胞的miR-146a表達(dá)水平。具體步驟包括：總miRNA提取，miRNA逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR，用2-△Ct將原始數(shù)據(jù)（△Ct值）轉(zhuǎn)化成線性形式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，再以2-△△CT方法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 小鼠腹腔異位心臟移植模型的建立及處理 取Balb/c小鼠心臟作為供體，以C57小鼠作為受體，構(gòu)建小鼠腹腔異位心臟移植模型[6-7]。實(shí)驗(yàn)分為NS對(duì)照組、Treg對(duì)照組、agomir組、antagomir組。于移植手術(shù)完成后立即經(jīng)陰莖背靜脈推注相應(yīng)轉(zhuǎn)染后的Treg細(xì)胞（數(shù)量均為106個(gè)）。術(shù)后小鼠分為兩部分，一部分小鼠每日經(jīng)腹壁觸摸移植心臟搏動(dòng)情況，直到供心停跳，記錄各組供心存活時(shí)間。另一部分小鼠在術(shù)后第5天處死，取部分移植心臟組織用福爾馬林固定，石蠟包埋后切片，行HE染色；流式檢測(cè)受體脾臟中T細(xì)胞亞群及Th細(xì)胞的比例；RT-PCR技術(shù)檢測(cè)術(shù)后 5 d供心IFN-γ、IL-4、IL-17mRNA的表達(dá)水平，實(shí)時(shí)定量PCR的實(shí)驗(yàn)方法同前，相關(guān)因子引物序列如下：

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)6次，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料表示為±s，兩樣本之間的比較采用t檢驗(yàn)，3組以上比較采用方差分析（one-way ANOVA），組間均數(shù)間多重比較采用最小顯著差法（least significant difference,LSD）。

2 結(jié)果

2.1 Treg細(xì)胞擴(kuò)增前后的純度及miR-146a表達(dá)水平檢測(cè) Treg細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增后，流式檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞數(shù)量達(dá)擴(kuò)增前的10倍，純度為92.3%,如圖1所示。RT-PCR結(jié)果顯示，擴(kuò)增前后Treg細(xì)胞miR-146a的表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。

圖1 Treg細(xì)胞擴(kuò)增前后的純度檢測(cè)Fig 1 The purity of Treg cells before and after cell amplification

表1 擴(kuò)增前后miR-146a的表達(dá)水平檢測(cè)Tab 1 Expression of miR-146a before and after cell amplification

2.2 各組小鼠心臟移植術(shù)后生存曲線分析 如圖2所示，與生理鹽水對(duì)照組相比，輸注空白Treg細(xì)胞能夠明顯延長(zhǎng)供心的生存時(shí)間，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用miR-146a agomir上調(diào)Treg細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)，能夠使供心生存時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)（P＜0.05），與之相反的是，輸注下調(diào)miR-146a的Treg細(xì)胞卻使得供心生存時(shí)間較空白Treg組顯著縮短（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠心臟移植術(shù)后生存曲線分析Fig 2 The survival curves of mice after heart transplantation in each group

2.3 各組小鼠心臟移植術(shù)后5 d供心病理分析 對(duì)術(shù)后5 d各組供心進(jìn)行了病理學(xué)分析，如圖3、表2、3所示，miR-146a上調(diào)組的急性排斥反應(yīng)病理分級(jí)較空白 Treg組顯著降低（P＜0.05），而 miR-146a下調(diào)組急性排斥反應(yīng)病理分級(jí)較空白Treg組顯著升高（P＜0.05）。

圖3 各組移植心臟HE染色Fig 3 HE-staining of donor hearts in each group

表2 各組移植心臟病理分級(jí)Tab 2 The pathological grades of donor hearts in each group

表3 各組間病理結(jié)果兩兩比較（P）Tab 3 Paired comparison of thepathologicalgradesineachgroup（P）

2.4 各組小鼠心臟移植術(shù)后5 d受體脾臟T細(xì)胞亞群檢測(cè) 流式結(jié)果顯示，與空白Treg組相比，miR-146a上調(diào)組CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P＜0.05），CD8+T細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯區(qū)別（P＞0.05），而 miR-146a下調(diào)組 CD4+、CD8+T 細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯區(qū)別（P＞0.05），如圖4和表4、5所示。

表4 各組受體小鼠術(shù)后5 d脾臟T細(xì)胞亞群分析Tab 4 Cells of spleen in recipients by flow cytometry on the 5th day after transplantation

表5 各組間CD4+結(jié)果兩兩比較（P）Tab 5 Paired comparison of CD4+in each group（P）

2.5 各組受體小鼠心臟移植術(shù)后5 d脾臟Th細(xì)胞亞群檢測(cè) 與空白Treg組相比，miR-146a上調(diào)組Th1、Th2和 Th17細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差別（P＞0.05）；而miR-146a下調(diào)組Th1細(xì)胞數(shù)量顯著升高（P＜0.05），Th2和Th17細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯區(qū)別（P＞0.05），如表6、7所示。

表6 各組受體小鼠術(shù)后5 d脾臟Th細(xì)胞亞群分析Tab 6 Th cells of spleen in recipients by flow cytometry on the 5th day after transplantation

表7 各組間Th1細(xì)胞結(jié)果兩兩比較（P）Tab 7 Paired comparison of Th1 cells in each group（P）

圖4 各組術(shù)后5 d受體脾臟T細(xì)胞亞群流式檢測(cè)Fig 4 T cells of spleen in recipients by flow cytometry on the 5th day after transplantation

2.6 各組受體小鼠心臟移植術(shù)后5 d供心相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平 如表8、9所示，與空白Treg組相比，miR-146a上調(diào)組供心IFN-γ、IL-4和IL-17的表達(dá)水平無(wú)明顯差別（P＞0.05）；而miR-146a下調(diào)組供心 IFN-γ 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），IL-4、IL-17的表達(dá)水平無(wú)明顯區(qū)別（P＞0.05）。

表8 各組受體小鼠術(shù)后5 d供心相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)Tab 8 Expression of related cytokines of donor hearts in recipients on the 5th day after transplantation

表9 各組間IFN-γ結(jié)果兩兩比較（P）Tab 9 Paired comparison of the expression of IFN-γ in each group（P）

3 討論

器官移植的最終目的是受體對(duì)移植物產(chǎn)生類似于自身耐受的狀態(tài)。早在1995年便有相關(guān)報(bào)道Treg細(xì)胞具有維持免疫耐受的作用。相關(guān)器官移植模型建立也表明其在維持免疫耐受的重要作用。Treg細(xì)胞作為一種治療手段在幾十年前出現(xiàn)[8]。Lee等通過(guò)小鼠骨髓移植模型證明了回輸Treg細(xì)胞可以有效的防止移植物抗宿主病的發(fā)生或延緩病程進(jìn)展。Treg是目前用于I期臨床試驗(yàn)較多的調(diào)節(jié)T細(xì)胞，其通過(guò)細(xì)胞接觸式和非細(xì)胞接觸式兩種方式實(shí)現(xiàn)免疫抑制。但是單一的抑制性細(xì)胞因子治療卻不能達(dá)到滿意的治療及抑制效果。而互噬作用可能會(huì)成為未來(lái)臨床免疫耐受研究的新途徑[9]。miRNA近年來(lái)成為免疫學(xué)領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，其能調(diào)控相關(guān)基因來(lái)影響免疫功能，進(jìn)而參與更多自身免疫疾病發(fā)展。研究表明，miR-146a在器官移植的免疫排斥過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，而且研究人員證實(shí)，miR-146a對(duì)于Treg細(xì)胞的功能發(fā)揮也起著重要作用[10-11]?；谙嚓P(guān)文獻(xiàn)，我們將不同miR-146a表達(dá)條件下Treg細(xì)胞在小鼠心臟移植后回輸體內(nèi)，假設(shè)被移植心臟抗原激活效應(yīng)T細(xì)胞，可被Treg細(xì)胞識(shí)別為自身反應(yīng)性T細(xì)胞，從而被抑制，由此在受體內(nèi)長(zhǎng)期存在的，針對(duì)移植抗原記憶的Treg細(xì)胞，形成自身耐受的耐受模式，這就是的本課題的研究思路。Treg細(xì)胞是通過(guò)細(xì)胞間的直接作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的[12]，結(jié)合體外抑制實(shí)驗(yàn)得出要想實(shí)現(xiàn)有效的抑制功能，必須要滿足足量的細(xì)胞數(shù)量。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，要想達(dá)到回輸?shù)挠行ё饔茫?xì)胞數(shù)量要達(dá)到106以上，而常規(guī)體外分選所得的Treg細(xì)胞數(shù)量極為有限[13]，因此獲得足夠細(xì)胞數(shù)量，一直困擾從事細(xì)胞回輸?shù)难芯咳藛T，2009年研究人員首次成功地用體外擴(kuò)增Treg細(xì)胞解決了細(xì)胞數(shù)量不足的困擾[14]。本實(shí)驗(yàn)采用擴(kuò)增試劑盒有效獲得滿意細(xì)胞數(shù)量，并維持了Treg細(xì)胞的細(xì)胞表型及免疫功能。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體內(nèi)回輸空白Treg及上調(diào)miR-146a表達(dá)后的Treg可減輕急性免疫排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)移植心臟存活期，減輕移植心臟病理炎癥反應(yīng)，上調(diào)組作用更為明顯。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-146a對(duì)Treg細(xì)胞起著重要的調(diào)控作用，上調(diào)Treg細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)能夠進(jìn)一步增強(qiáng)其抑制功能，其具體機(jī)制也有待于進(jìn)一步深入研究。但是，我們的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)回輸下調(diào)miR-146a的Treg細(xì)胞后，生存時(shí)間較空白Treg組縮短，病理分級(jí)明顯升高。在對(duì)移植物Th細(xì)胞的流式檢測(cè)中我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)組Th1較Treg對(duì)照組及上調(diào)組明顯升高，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞因子IFN-γ也明顯升高。由此可知下調(diào)miR-146a的Treg細(xì)胞抑制功能受到破壞，其具體機(jī)制可能是下調(diào)Treg細(xì)胞的miR-146a表達(dá)水平使其抑制Th1分泌IFN-γ的功能受損[15]。綜上所述，體外能有效的分選和擴(kuò)增Treg細(xì)胞，且不影響miR-146a的表達(dá)。回輸Treg明顯抑制小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)，上調(diào)組抑制功能增強(qiáng)，下調(diào)組抑制功能減弱。但是回輸后的Treg細(xì)胞能否在體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，或者細(xì)胞不斷凋亡對(duì)于移植免疫反應(yīng)的影響還需進(jìn)一步研究。關(guān)于miR-146a和Treg細(xì)胞在心臟移植免疫耐受的作用及機(jī)制還需要更深入的研究。