安茜，周雅莉，宋亞楠，岳敏，趙熙寧，王計(jì)平，李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

杜氏鹽藻(DunaliellaSalina) 是一種無細(xì)胞壁，可以在高鹽、高溫條件下生存的光合自養(yǎng)的單細(xì)胞真核綠藻，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最耐鹽的生物之一[1]。它能高水平富集類胡蘿卜素，糖類及油脂等，可作為天然的優(yōu)質(zhì)保健品，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。盡管對杜氏鹽藻耐鹽機(jī)制和類胡蘿卜素等天然產(chǎn)物的代謝機(jī)理進(jìn)行了諸多研究，但類胡蘿卜素生物合成及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有待深入解析[2,3]。

類胡蘿卜素是一種天然色素，廣泛分布于微生物和植物光合組織中[4]。它是一種含8個(gè)異戊二烯單位的四萜類化合物， 由2個(gè)二萜縮合而成[5]。植物類胡蘿卜素生物合成的前體物質(zhì)為異戊烯二磷酸(isopenteny diphosphate, IPP)[6～8]。IPP可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上由乙酰CoA經(jīng)羥甲基戊二酰-CoA途徑(mevalonate, MVA)合成, 更多的是在質(zhì)體內(nèi)由磷酸甘油醛與丙酮酸經(jīng)2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP)合成[6～8]。形成的IPP經(jīng)多次縮合生成第一個(gè)類胡蘿卜素即八氫番茄紅素(phytoene),再經(jīng)脫氫、環(huán)化、羥基化、環(huán)氧化等生物化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌惡}卜素。

番茄紅素(lycopene)環(huán)化是植物體內(nèi)類胡蘿卜素生物合成途徑中的一個(gè)重要部分，它是由番茄紅素 β-環(huán)化酶(lycopene β-cyclase, LYCB)和番茄紅素 ε-環(huán)化酶(lycopene ε-cyclase,LYCE)共同催化[9]。在合成β-胡蘿卜素時(shí)，LYCB經(jīng)過2次催化反應(yīng)將番茄紅素先轉(zhuǎn)化為γ-胡蘿卜素，然后再生成β-胡蘿卜素(β-carotene)。在合成α-胡蘿卜素時(shí)，番茄紅素先在LYCE催化下，生成δ-胡蘿卜素，然后再在LYCB催化下，生成α-胡蘿卜素(α-carotene)。但是，在萵苣中有一種特殊的LYCE，可以將番茄紅素催化生成ε-胡蘿卜素[10]。Stickforth等在藍(lán)細(xì)菌中分離并鑒定了一種新的環(huán)化酶，可催化形成β-環(huán)和ε-環(huán)，將番茄紅素催化生成α-胡蘿卜素[11]。

番茄紅素β-環(huán)化酶(LYCB)是β-胡蘿卜素合成途過程的關(guān)鍵酶之一，其在基因轉(zhuǎn)錄活性水平上影響著上游番茄紅素和下游β-胡蘿卜素等產(chǎn)物的積累。Moreno等發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)DcLCYb1胡蘿卜中β-胡蘿卜素顯著提高，而沉默DcLCYb1時(shí)會降低β-胡蘿卜素的含量[12]；柑橘中LCYB表達(dá)量下調(diào)會導(dǎo)致番茄紅素的積累[13～15]。因此，本研究選用從運(yùn)城鹽湖中分離獲得的一株生長較好，β-胡蘿卜素含量較高的杜氏鹽藻株系Ds-YC011為試驗(yàn)材料，通過高保真PCR擴(kuò)增，獲得DsLYCB基因的cDNA克隆，并應(yīng)用生物信息學(xué)手段分析該酶蛋白理化性質(zhì)。同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析在高鹽(3 mol·L-1NaCl)脅迫下，DsLYCB的表達(dá)模式，進(jìn)一步測試了藻細(xì)胞中β-胡蘿卜素含量的變化。本文為進(jìn)一步研究DsLYCB的功能及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藻種及培養(yǎng)

杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)株系Ds-YC011由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源所從山西運(yùn)城鹽湖分離和保存。鹽藻培養(yǎng)基為DM培養(yǎng)基，25 ℃，1 250 lx光強(qiáng)，光暗比1∶1，每天搖瓶2～3次。RNA 提取試劑Trizol 購自 Invitrogen 公司，AMV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒為abm試劑盒，凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自北京天根生物公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 杜氏鹽藻總RNA的提取

取生長至對數(shù)期的本地鹽藻，收集藻細(xì)胞，按照Trizol法提取鹽藻總RNA。-80 ℃保存，備用。

1.2.2 杜氏鹽藻LYCB基因的擴(kuò)增

參考abm試劑盒使用方法進(jìn)行操作。用經(jīng)過濃度和純度測定后的總RNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系參照說明書，反應(yīng)條件：25 ℃，10 min；42 ℃，15 min；85 ℃，5min，得到的cDNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。依據(jù) GeneBank 中杜氏鹽藻(D.salina)DsLYCB基因轉(zhuǎn)錄本序列 (EU327 876.1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長的引物L(fēng)YCB-F：5’-CGCGGATCCATGCAGGCCCTGCAGCAA-3’和LYCB-R:5’-CCCAAGCTTTCAACTTTTTTGTCCTTGCG-3’。高保真RT-PCR 反應(yīng)采用Pfu DNA Polymerase 酶，反應(yīng)體系參照說明書，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，58 ℃退火30 s, 68 ℃延伸2 min 30 s，30 次循環(huán)，68 ℃ 保溫 15 min，16 ℃ 15 min。將所有擴(kuò)增片斷純化回收后連接到PMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5-α中，篩選出陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA送通用生物公司(安徽) 測序。

1.2.3DsLYCB的生物信息學(xué)分析

將上述獲得的序列在NCBI-ORF(Open Reading Frame，ORF)中查找其開放閱讀框并將核酸、氨基酸進(jìn)行比對[16]。通 過 ExPASy-ProParam 工具(http：//www.expasy.ch/tools/protparam.htmL)對該蛋白質(zhì)進(jìn)行基本的理化性質(zhì)分析。利用ProtScale對該蛋白序列進(jìn)行親水性/疏水性分析。利用SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/np)預(yù)測并分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/repository/)同源建模數(shù)據(jù)庫對該蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測[17]。應(yīng)用 CBS預(yù)測信號肽、轉(zhuǎn)運(yùn)肽及其跨膜結(jié)構(gòu)域[18,19]。利用MEGA 7.0 軟件采用NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[20]。

1.2.4 熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析

向正常條件(1.5 mol·L-1NaCl)培養(yǎng)至對數(shù)生長期的鹽藻培養(yǎng)液中添加固體NaCl，使其終濃度達(dá)到3 mol·L-1，在25 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。分別提取高鹽脅迫0 h(對照)、1、4、12、24 h 的鹽藻的總RNA。3個(gè)生物學(xué)重復(fù)提取藻細(xì)胞總RNA。用核酸濃度儀測定提取的總RNA 的純度和濃度。取各RNA 樣品2 μL用于反轉(zhuǎn)錄。DsLYCB基因熒光定量引物為：LYCB-F：5’-TGCAAATGCTCTTTGTCCTG-3’和LYCB-R:5’-CCCTGTCTGCGTAGTCATCA-3’，18 S內(nèi)參引物為：

N-1∶5’-TTGGGTAGTCGGGCTGGTC-3’，N-2∶5’-CGCTGCGTTCTTCATCGTT-3’[21]。熒光定量PCR反應(yīng)體系為：Eva Green 2X qPCR 反應(yīng)液5 μL，上下游引物各0.3 μL，cDNA 模板0.5 μL，ddH2O 3.9 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，57 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線。采用2-ΔΔCt法計(jì)算DsLYCB基因的相對表達(dá)量含量[22]。通過SPSS 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 杜氏鹽藻類胡蘿卜素的提取及其含量的測定

經(jīng)高鹽處理后的杜氏鹽藻，分別取脅迫0 h(對照)、1、4、12、24 h的藻液20 mL，采用周靜等人[23]的方法提取類胡蘿卜素并測定其含量。

2 結(jié)果

2.1 杜氏鹽藻LYCB基因克隆

對源于鹽藻藻株Ds-YC011藻細(xì)胞cDNA進(jìn)行高保真RT-PCR擴(kuò)增目標(biāo)cDNA, 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離結(jié)果(圖1)顯示，RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增出一條長度約為1 970 bp的目標(biāo)條帶。經(jīng)測序獲得1 910 bp的核苷酸序列。編碼區(qū)序列與NCBI GeneBank 中杜氏鹽藻LYCB基因(EU327 876.1)序列比對結(jié)果表明，從Ds-YC011鹽藻株系擴(kuò)增的DsLYCBcDNA克隆與GeneBank中錄入的杜氏鹽藻LYCB基因核酸序列有4%的差異，但推測的氨基酸序列無差異。這表明分離獲得了正確的DsLYCBcDNA克隆。

圖1 杜氏鹽藻DsLCYB基因的 cDNA克隆Fig.1 cDNA clone of DsLCYB gene in D. salina注：M為Marker；A、B、C為DsLYCB全長Note: M is Marker; A, B, C are full length of DsLYCB

2.2 杜氏鹽藻DsLCYB酶蛋白特性的生物信息學(xué)分析

上述擴(kuò)增到的杜氏鹽藻DsLCYB基因cDNA全長為1 910 bp，其中 5’非翻譯為 83 bp，3’非翻譯為72 bp，開放閱讀框(ORF)1 755 bp(核苷酸序列位置84～1 838)，編碼 584 個(gè)(核苷酸序列位置84～1 838)，編碼 584 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖2)。

推導(dǎo)的該蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)(pI) 為 7.66，相對分子質(zhì)量64 541.99Da。負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)數(shù)為57，正電荷殘基(Arg+Lys)數(shù)為58，不穩(wěn)定系數(shù)為35.32，因此將該蛋白歸為穩(wěn)定蛋白，其疏水性平均值為-0.183，表現(xiàn)為親水性，無明顯的疏水區(qū)域。DsLCYB基因編碼氨基酸序列通過 ProtScale 軟件進(jìn)行親水性/疏水性分析，結(jié)果表明，杜氏鹽藻DsLCYB蛋白第152 位 Arg疏水性最強(qiáng)，分值達(dá)到-2.530，第104 位Ile親水性最強(qiáng)，分值達(dá)到1.380，預(yù)測該蛋白為疏水性蛋白(圖3)。在CBS 軟件上對杜氏鹽藻DsLCYB 蛋白進(jìn)行的亞細(xì)胞定位預(yù)測，其結(jié)果表明，杜氏鹽藻DsLCYB 蛋白沒有信號肽和跨膜區(qū)域，為非分泌蛋白，該蛋白定位在葉綠體。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，無規(guī)則卷曲占39.73%，α-螺旋占39.9%。使用SWISS-Model 在線預(yù)測分析 DsLCYB 蛋白3D結(jié)構(gòu)(圖4)顯示，結(jié)果表明與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測一致。

圖2 杜氏鹽藻DsLCYB 基因cDNA全長及其推導(dǎo)氨基酸序列Fig.2 DsLCYB gene cDNA sequence and its deduced amino acid sequence

圖3 杜氏鹽藻DsLCYB蛋白疏水性預(yù)測Fig.3 Prediction of DsLCYB protein hydrophobicity

圖4 杜氏鹽藻DsLCYB蛋白三級結(jié)構(gòu)模擬Fig.4 3 D structure of DsLCYB protein from Dunaliella salina

2.3 杜氏鹽藻DsLYCB與其他植物L(fēng)YCB蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

以DsLYCB 蛋白序列為搜索序列。對NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 Blast分析。從BLAST獲得序列中選取與DsLYCB同源性較高的 12 個(gè)物種的LYCB蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。 這12個(gè)LYCB蛋白分別來自雨生紅球藻(Haematococcuslacustris)、佐夫色綠藻(Chromochloriszofingiensis)、萊茵衣(Chlamydomonaseustigma)、團(tuán)藻(Volvoxcarterif.nagariensis)、單針藻(Monoraphidiumneglectum)、膠球藻(CoccomyxasubellipsoideaC-169)、微茫藻(Micractiniumconductrix)、原殼小球(Auxenochlorellaprotothecoides)、克萊門柚(Citrusclementina)、山崳菜(Eutremasalsugineum)、江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)和風(fēng)疹薺菜(Capsellarubella)。結(jié)果(圖5)顯示：這12個(gè)LYCB蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹共分為兩大支，即8個(gè)藻類LYCB聚為一枝，4個(gè)高等植物的LYCB聚為另一枝。杜氏鹽藻DsLYCB與雨生紅球藻LYCB蛋白親緣關(guān)系最近， 與萊茵衣藻LYCB蛋白親緣關(guān)系次之。

2.4 杜氏鹽藻DsLYCB在高鹽脅迫下的表達(dá)分析及其對類胡蘿卜素積累的影響

提取的各樣品藻細(xì)胞總RNA，經(jīng)核酸濃度儀測定OD260/280均在1.8～2.2，可以用作隨后cDNA合成和熒光定量PCR檢測DsLYCB基因的表達(dá)譜。定量表達(dá)分析結(jié)果(圖6)表明，高鹽脅迫下，DsLYCB基因表達(dá)量明顯上升，在脅迫4 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，為正常生長條件(1.5 mol·L-1)下的2倍，差異達(dá)到著水平(P<0.05)。在脅迫后期，DsLYCB表達(dá)量逐漸下降，但仍顯著高于對照正常條件下表達(dá)量。說明DsLYCB基因?yàn)辂}脅迫上調(diào)表達(dá)基因。對高鹽脅迫處理?xiàng)l件下杜氏鹽藻藻細(xì)胞中類胡蘿卜素含量測試(圖7)顯示，隨著高鹽脅迫時(shí)間增加，杜氏鹽藻類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)上升趨勢，在脅迫1～4 h期間增加最快，12 h后類胡蘿卜素含量趨于穩(wěn)定。顯然，在高鹽脅迫條件下，DsLYCB基因表達(dá)譜變化模式與藻細(xì)胞富集類胡蘿卜素動態(tài)過程呈正相關(guān)性。

圖5 杜氏鹽藻DsLYCB與其他12種植物L(fēng)YCB蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of the LYCB proteins from Dunaliella salina and other 12 organisms

圖6 杜氏鹽藻DsLYCB基因在3 mol·L-1鹽脅迫下表達(dá)量變化Fig.6 Expression of DsLYCB gene in Dunaliella salina at 3 mol·L-1 salt stress

圖7 高鹽脅迫對杜氏鹽藻類胡蘿卜素積累的變化Fig.7 Effect of high salt stress on carotenoid acculmulation in Dunaliella salina

3 討論

藻類類胡蘿卜素合成途徑與植物相似，在類胡蘿卜素合成過程中，番茄紅素 β- 環(huán)化酶(LYCB)在類胡蘿卜素次生代謝途徑中可直接將番茄紅素催化生成β-胡蘿卜素。2006年，陶俊等從枇杷中分離并獲得番茄紅素β-環(huán)化酶基因的片段[24]；張建成等從紅肉臍橙中克隆到β-環(huán)化酶基因片段[25]；同時(shí)LYCB基因也應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)中，梁燕等從胡蘿卜獲得番茄紅素β-環(huán)化酶的反義RNA并將該基因轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化胡蘿卜株組織中的胡蘿卜素含量相對較高[26]。晏露等從杜氏鹽藻中克隆到番茄紅素β-環(huán)化(LYCB)基因[27]。杜氏鹽藻在極端條件下可以大量積累類胡蘿卜素，但是，在這些研究中，分離得到的大多為cDNA序列，但是對其作用機(jī)理研究較少。

本研究從運(yùn)城鹽湖分離的一株鹽藻(Ds-YC011)中擴(kuò)增獲得DsLYCB基因的cDNA全長序列，利用生物信息學(xué)對該基因氨基酸的特性及其空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和預(yù)測，并且研究了在高鹽脅迫下不同時(shí)期的表達(dá)量的變化及類胡蘿卜素含量的變化。杜氏鹽藻LYCB全長1 910 bp，開放閱讀框(ORF)長1 769 bp，編碼584個(gè)氨基酸。LYCB為不穩(wěn)定親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示該蛋白分子中α-螺旋結(jié)構(gòu)最多，占39.9%。同源比對結(jié)果表明，杜氏藻DsLYCB蛋白與雨生紅球藻親緣關(guān)系最近。經(jīng)過高鹽脅迫，DsLYCB基因的表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的增加呈先升高后緩慢降低的趨勢，但總體表達(dá)量顯著高于對照。類胡卜素含量隨著脅迫時(shí)間的增加，表現(xiàn)為先上升后基本穩(wěn)定的趨勢，但類胡蘿卜素含量總體高于對照。高鹽脅迫上調(diào)杜氏鹽藻DsLYCB基因的表達(dá)量，且DsLYCB基因表達(dá)譜與類胡蘿卜素富集模式相吻合。

本研究通過克隆獲得了杜氏鹽藻DsLYCB基因 cDNA 全長序列，對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并對其進(jìn)行鹽脅迫表達(dá)分析，為在杜氏鹽藻中DsLCYB調(diào)節(jié)β-胡蘿卜素生物合成的分子機(jī)制奠定了分子基礎(chǔ)。