季春麗，劉天中，李潤(rùn)植*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801；2.中國(guó)科學(xué)院 青島生物能源與過(guò)程研究所，山東 青島 266101)

隨著人類文明不斷發(fā)展以及對(duì)能源需求的與日俱增和化石燃料日益枯竭，當(dāng)今世界正在面臨能源危機(jī)。大力發(fā)展太陽(yáng)能、風(fēng)能、生物質(zhì)能和核能等清潔能源是解決能源危機(jī)的有效途徑，生物質(zhì)能源由于具有可再生、安全、無(wú)CO2凈釋放等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注，尤其是應(yīng)用微藻生產(chǎn)生物柴油等生物燃料被認(rèn)為是唯一有潛力替代化石燃油的綠色能源[1, 2]。微藻為原核或真核單細(xì)胞或簡(jiǎn)單細(xì)胞群體的光自養(yǎng)微生物，種類繁多，分布廣泛。與傳統(tǒng)的生物質(zhì)原料相比，微藻具有更高的光合作用效率和固碳能力以及富集油脂的特性[3, 4]，生長(zhǎng)快速且生長(zhǎng)周期短[5]，不受季節(jié)限制，不占用耕地，還可以利用廢水、再生水及海水進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)，無(wú)需消耗有限的淡水資源[6]。除了用作能源生產(chǎn)外，微藻在食品、醫(yī)藥、化妝品、肥料、飼料和功能農(nóng)業(yè)等其它領(lǐng)域也被廣泛應(yīng)用，具有很高的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和社會(huì)價(jià)值[7, 8]。

然而，大規(guī)模獲得微藻生物質(zhì)和微藻生物能源產(chǎn)品成本過(guò)高是目前微藻生物能源技術(shù)面臨的兩大瓶頸[1]。因此，提高微藻的培養(yǎng)效率和產(chǎn)油率以及降低其大規(guī)模培養(yǎng)成本是微藻生物燃油研發(fā)領(lǐng)域的重要任務(wù)?，F(xiàn)今工業(yè)化微藻培養(yǎng)均采用液體懸浮式培養(yǎng)，主要包括開放式培養(yǎng)池(open pond)與密閉式光生物反應(yīng)器(closed photobioreactor, PBR)2種形式。開放式培養(yǎng)池的建造和運(yùn)行成本較低，但藻細(xì)胞生長(zhǎng)速度與培養(yǎng)密度均較低，且占地面積大，易被雜藻污染。PBR培養(yǎng)可顯著提高藻細(xì)胞生長(zhǎng)速度與培養(yǎng)密度，但造價(jià)昂貴、運(yùn)行成本高、維護(hù)困難、難以規(guī)?；痆9]。這些傳統(tǒng)液體懸浮式培養(yǎng)方式的共同特點(diǎn)是水分占整個(gè)液體培養(yǎng)體系的90%以上，大量的水環(huán)境不利于CO2傳質(zhì)和微藻對(duì)光和CO2的吸收利用。因?yàn)楣庠催M(jìn)入水中都會(huì)有不同程度的衰減，為了更好的氣液接觸和培養(yǎng)液的混合以利于微藻光合固碳，需要使用攪拌等裝置，這不僅增加了微藻培養(yǎng)成本，也帶來(lái)了能耗、散熱等一系列問(wèn)題，而且機(jī)械攪拌產(chǎn)生的剪切力也會(huì)對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生損傷。此外，大量水介質(zhì)也給微藻的收獲造成困難，增加了生產(chǎn)成本。新近建立的微藻半固定化生物膜貼壁培養(yǎng)方法呈現(xiàn)諸多優(yōu)點(diǎn)，如涉水量小、細(xì)胞密度大、生長(zhǎng)快速和采收便捷等，能克服傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)方式耗水量大、能耗高、藻體采收和規(guī)?；囵B(yǎng)困難等問(wèn)題[10～13]，因此，應(yīng)用該方法規(guī)?；囵B(yǎng)微藻有望顯著提高微藻生物質(zhì)原料供給量，從而推動(dòng)能源微藻產(chǎn)業(yè)及耦合環(huán)境治理等的發(fā)展。

前期研究結(jié)果證明柵藻(Scenedesmusobliquus)、葡萄藻(Botryococcusbraunii)、雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)、螺旋藻(Spirulinaplatensis)、紫球藻(Porphyridiumcruentum)等均可在貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)上較好地生長(zhǎng)并積累目標(biāo)代謝產(chǎn)物[10, 14～17]。而且，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法相比，貼壁培養(yǎng)用水量可減少90%，能耗顯著降低，采收簡(jiǎn)便易行[18, 19]。然而，與傳統(tǒng)液體懸浮培養(yǎng)類似，貼壁培養(yǎng)亦需要精準(zhǔn)調(diào)控營(yíng)養(yǎng)元素供給以獲得高目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)量。通常在營(yíng)養(yǎng)充足和環(huán)境條件比較理想時(shí)，微藻生物量大，但油脂積累少。相反，在營(yíng)養(yǎng)脅迫情況下，微藻生物量低，但能大量積累油脂等目標(biāo)產(chǎn)物。營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫中，氮脅迫是最重要的影響油脂合成的因素，大多數(shù)微藻在缺氮條件下可大量積累油脂，尤其是甘油三脂(TAG)[20, 21]。TAG是中性脂的主要成分，是真核生物細(xì)胞中重要的儲(chǔ)能物質(zhì)，也是將碳轉(zhuǎn)變?yōu)槭称泛蜕锊裼偷雀咧诞a(chǎn)品的主要來(lái)源[22]，還是生產(chǎn)符合ASTM標(biāo)準(zhǔn)的生物柴油的主要原料[23, 24]。因此，建立優(yōu)化的氮元素供給策略對(duì)規(guī)模化應(yīng)用貼壁培養(yǎng)技術(shù)養(yǎng)殖微藻，特別對(duì)提高富油微藻產(chǎn)油量和生產(chǎn)效率至關(guān)重要。

本文以一種淡水綠藻柵藻(Scenedesmusobliquus)為模式藻，分別研究在貼壁培養(yǎng)條件下，氮元素供給包括恒定氮濃度和總氮量(不同培養(yǎng)基體積)對(duì)柵藻生長(zhǎng)和產(chǎn)油的影響，進(jìn)一步制定了微藻貼壁培養(yǎng)條件下氮供給優(yōu)化策略，旨在為建立低耗、高效、可持續(xù)的微藻規(guī)模培養(yǎng)工藝體系提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藻種與培養(yǎng)

藻種：試驗(yàn)所用的柵藻(Scenedesmusobliquus)為實(shí)驗(yàn)室從青島水域篩選所得，保藏于本實(shí)驗(yàn)室中。

培養(yǎng)：將柵藻藻種接種于長(zhǎng)0.8 m，直徑為0.05 m的玻璃管中，玻璃管中加入700 mL BG-11培養(yǎng)基使接種濃度大約為0.1 g·L-1，含有2% CO2(v∶v)的壓縮空氣以0.25 v·v-1·min-1(通氣速率(L·min-1)與培養(yǎng)液體積(L)的比值)的速率通入玻璃管藻液中提供碳源并混勻藻液。將藻液放在連續(xù)光照強(qiáng)度為(100±5)μmol·m-2·s-1和溫度為(25±1)℃的環(huán)境中培養(yǎng)7 d后收獲并留作后續(xù)貼壁培養(yǎng)接種用。

BG-11培養(yǎng)基組成為：1 L BG-11培養(yǎng)基中含有1.5 g NaNO3、0.075 g MgSO4·7H2O、0.036 g CaCl2·2H2O、0.047 5 g K2HPO4·3H2O、0.02 g Na2CO3、6.562×10-3g一水檸檬酸、1.0×10-3g Na2EDTA、6.0×10-3g檸檬酸鐵銨、2.22×10-4g ZnSO4·7H2O、6.9×10-5g CuSO4·5H2O、1.81×10-3g MnCl2·4H2O、3.9×10-4g Na2MoO4·2H2O、4.94×10-5g Co(NO3)2·6H2O和2.86×10-3g H3BO3。

1.2 貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)

貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)為單層豎直板系統(tǒng)(single layer vertical plate system)[10]，接種密度約為10 g·m-2，試驗(yàn)裝置圖如圖1所示。為了測(cè)定培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)元素恒定氮濃度對(duì)柵藻貼壁生長(zhǎng)和油脂積累的影響，培養(yǎng)基從體系中流出后一般直接廢棄(圖1 B)，而為了測(cè)定培養(yǎng)基中氮總量(培養(yǎng)基體積)對(duì)一定量的藻細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)油影響則培養(yǎng)基會(huì)在體系中利用蠕動(dòng)泵循環(huán)使用(圖1 C)。將貼壁培養(yǎng)體系放在(25±1)℃的環(huán)境中進(jìn)行微藻貼壁培養(yǎng)，含有2%濃度CO2的壓縮空氣以0.17 v·v-1·min-1(通氣速率(L·min-1)與反應(yīng)器體積(L)的比值)速率直接通入反應(yīng)器中，并在反應(yīng)器上方放置燈管使培養(yǎng)光強(qiáng)為(100±5) μmol·m-2·s-1。

圖1 貼壁培養(yǎng)裝置圖Fig.1 Schematic diagram of the attached photobioreactor

1.3 生物量測(cè)定方法

在貼壁系統(tǒng)接種前，將一定量的藻液(V/L)用抽濾裝置過(guò)濾到預(yù)先稱重(W1/g)的混合膜上，然后用清水沖洗2～3次以除去藻細(xì)胞中殘留的營(yíng)養(yǎng)鹽成分等，將濾膜放到烘箱里105 ℃下烘至恒重(W2/g)，通過(guò)細(xì)胞干重和藻液的體積來(lái)確定藻液的濃度(Ct/g·L-1)以便于接種工作。

Ct=(W2-W1)/V

(1)

當(dāng)細(xì)胞收獲時(shí)，將濾膜上的藻細(xì)胞沖洗下來(lái)并按上述方法抽濾烘干稱干重(DW/g)，由于藻細(xì)胞在濾膜上的接種面積為1×10-3m2，則濾膜上的細(xì)胞濃度(DWt/g·m-2)為：

DWt=DW/0.001

(2)

收獲時(shí)，相應(yīng)的生物量產(chǎn)率(P/g·m-2·d-1)為：

P=(DWt-DW0)/t

(3)

其中，DW0為接種時(shí)的細(xì)胞濃度/g·m-2，t為培養(yǎng)時(shí)間/d。

1.4 藻細(xì)胞中總脂含量的測(cè)定

將待測(cè)藻細(xì)胞用水從濾膜上沖洗下來(lái)，反復(fù)離心棄上清，將藻渣冷凍干燥后稱取0.05 g左右的藻粉(Wc/g)放入研缽并加入約200 mg石英砂一起研磨，用7.5 mL甲醇-氯仿混合液(甲醇∶氯仿=2∶1，v∶v)將研磨后的藻粉和石英砂的混合物分?jǐn)?shù)次全部轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中并高速震蕩5 min使其均勻混合，然后將其密封置于37 ℃搖床24 h后取出離心，將上清置于新管中，并在藻渣混合物中再加入7.5 mL甲醇-氯仿混合液，振蕩均勻后置于37 ℃搖床2 h，取出后再次離心并將上清與上次的合并，然后向合并液中再加入5 mL 氯仿和9 mL 1% 的NaCl溶液，使得最終混合液中的甲醇、氯仿、水相比例為2∶2∶1.8，將此混合液混合均勻后離心收集下層有機(jī)相，并將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到預(yù)稱重的玻璃小管中，在60 ℃下用氮?dú)獯蹈桑賹⑿〔Ａ糠旁?0 ℃真空干燥箱中烘干3 h稱重得到總脂重量(W/g)，則藻細(xì)胞中總脂含量(TL)為：

TL=W/Wc

(4)

1.5 總脂中TAG含量的測(cè)定

將上述烘干后的總脂加入一定量的氯仿進(jìn)行溶解，使總脂濃度約為5 g·L-1，然后用微量進(jìn)樣器吸取1 μL樣品在棒狀薄層色譜的層析棒原點(diǎn)處分4～5次進(jìn)行點(diǎn)樣，待晾干后將層析棒先放入一展溶液(苯∶氯仿∶乙酸=150∶60∶2)中進(jìn)行展開，晾干后放入二展溶液中(苯∶正已烷=1∶1)再進(jìn)行展開，待展開都完成后，將層析棒在70 ℃烘箱中烘干3 min，最后將層析棒放入棒狀薄層色譜儀器中進(jìn)行分析，設(shè)定色譜中空氣流速為2 L·min-1，氫氣流速為160 mL·min-1。對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行分析時(shí)，可根據(jù)樣品中的組分保留時(shí)間以及樣品峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)行對(duì)照從而確定TAG的含量。

1.6 溶液中硝態(tài)氮濃度和細(xì)胞中氮含量的測(cè)定

溶液中硝態(tài)氮的測(cè)定采用紫外分光分度法[25]，取5 mL待測(cè)溶液離心，取3 mL上清液放入石英比色皿并用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其在波長(zhǎng)為220 nm下的吸收值(OD220)，為了使結(jié)果準(zhǔn)確可信，每次測(cè)量值的范圍應(yīng)該在0.1～0.8之間，如超過(guò)這一量程，應(yīng)該對(duì)待測(cè)溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?。在測(cè)量前先用標(biāo)準(zhǔn)品配制一系列不同濃度硝酸鹽溶液，并用此方法測(cè)量各不同濃度對(duì)應(yīng)的OD220并作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后待測(cè)溶液中硝態(tài)氮濃度(C/mmol·L-1)可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和其紫外吸收值進(jìn)行計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算公式為：

C=0.2763 ×OD220+ 0.0055 (r2>0.99)

(5)

細(xì)胞中氮元素含量占細(xì)胞干重的百分比用元素分析儀在1 140 ℃的燃燒溫度下并用氦氣作為運(yùn)載氣體的設(shè)定條件下進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 恒定氮濃度對(duì)柵藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響

圖2 恒定氮濃度對(duì)柵藻(培養(yǎng)7 d)(A)生物量濃度和(B)生物量產(chǎn)率的影響Fig.2 The biomass concentration(A) and biomass productivity(B)of S. obliquus under different constant nitrate concentrations after 7 days cultivation

由圖2A可以看出，各恒定氮濃度下柵藻生物量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，而且藻的生物量產(chǎn)量和產(chǎn)率在一定范圍內(nèi)與恒定氮濃度呈正相關(guān)，說(shuō)明氮濃度是影響柵藻生長(zhǎng)的一個(gè)因素。圖2B顯示，當(dāng)?shù)獫舛葹?7.65 mmol·L-1(正常BG-11中氮濃度)時(shí)，生物量產(chǎn)率達(dá)到最大，為10.48 g·m-1·d-1，當(dāng)?shù)獫舛葹?.76 mmol·L-1(為正常BG-11氮濃度的1/10)時(shí)，對(duì)應(yīng)生物量產(chǎn)率為9.17 g·m-1·d-1，當(dāng)?shù)獫舛却笥谶@一值時(shí)，柵藻的生物量產(chǎn)率增長(zhǎng)并不明顯，說(shuō)明在正常BG-11中的氮濃度對(duì)柵藻生長(zhǎng)是過(guò)量的。

恒定氮濃度對(duì)柵藻中總脂含量和產(chǎn)率的影響如圖3 A所示，總脂積累會(huì)隨著氮濃度的增加呈減少的趨勢(shì)，尤其是當(dāng)?shù)獫舛雀哂?.76 mmol·L-1時(shí)，油脂含量下降較明顯，而且氮濃度偏高或偏低都會(huì)降低藻中的油脂產(chǎn)率，只有當(dāng)在一個(gè)合適的氮濃度時(shí)，生物量和油脂含量均較高，而油脂產(chǎn)率達(dá)到最大值。當(dāng)?shù)獫舛葹?.76 mmol·L-1時(shí)，油脂產(chǎn)率達(dá)到最大值(3.80 g·m-2·d-1)。由此結(jié)果可知，在貼壁條件下，“一步法”產(chǎn)油是可行的，即生物量和油脂積累同時(shí)進(jìn)行。恒定氮濃度對(duì)柵藻中TAG含量和產(chǎn)率的影響如圖3 B所示，TAG積累情況與總脂的類似，即其含量會(huì)隨著氮濃度的增加而減少，而氮濃度偏高或偏低均會(huì)降低其產(chǎn)率。當(dāng)?shù)獫舛葹?.76 mmol·L-1時(shí)，TAG產(chǎn)率達(dá)到最大，為2.01 g·m-2·d-1。試驗(yàn)結(jié)果表明，缺氮會(huì)導(dǎo)致藻中TAG含量增長(zhǎng)，說(shuō)明氮濃度是影響TAG含量的一個(gè)重要因素，所以調(diào)控溶液中氮濃度是實(shí)現(xiàn)調(diào)控TAG含量的一個(gè)重要途徑。

圖3 恒定氮濃度對(duì)柵藻(培養(yǎng)7 d)(A)總脂和(B)TAG含量及產(chǎn)率的影響Fig.3 The(A)total lipid and(B)TAG accumulation of S. obliquus under different constant nitrate concentrations after 7 days cultivation

各恒定氮濃度下培養(yǎng)7 d后細(xì)胞形態(tài)如圖4所示(圖中右下角標(biāo)尺為10 μm)，在接種時(shí)(生長(zhǎng)第0天)，細(xì)胞很綠且呈梭狀，四聚體較多。7 d后，細(xì)胞在各氮濃度下均有一定程度的變黃、聚集、衰老和裂解，且這種現(xiàn)象隨氮濃度的減少而加重，而且氮濃度很低時(shí)，變黃細(xì)胞中有的有油滴存在，說(shuō)明缺氮更利于誘導(dǎo)藻細(xì)胞產(chǎn)油。

本試驗(yàn)證明了氮濃度對(duì)柵藻的生長(zhǎng)和油脂積累有重要影響，對(duì)一定接種量的藻細(xì)胞，多少氮支持多大的生物量和油脂產(chǎn)量以及以怎樣的方式提供氮源最為合適有待進(jìn)一步考察。

2.2 總氮量對(duì)柵藻生物量和油脂積累的影響

確定了最佳氮濃度(1.76 mmol·L-1)后，考察不同體積(0.1、0.3、0.5、1、3 L)1.76 mmol·L-1的培養(yǎng)基即對(duì)應(yīng)氮總量為0.176、0.528、0.88、1.76、5.28 mmol NaNO3對(duì)一定接種量(～10 g·m-2, ～160 cm2)柵藻的影響，試驗(yàn)裝置如圖1 C，培養(yǎng)基采取循環(huán)方式，流出液回收并循環(huán)用于培養(yǎng)，從而確保培養(yǎng)基總量一定，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

由圖5 A可以看出，溶液中總氮量越少，氮消耗速度越快。但是各組中的氮幾乎都在第5天消耗完，第5天后，各組溶液中的氮濃度波動(dòng)不大，波動(dòng)范圍在0.062～0.166 mmol·L-1。由圖5 B可以看出，生物量與溶液中的總氮量呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)溶液中總氮含量大于0.88 mmol 時(shí)，生物量增長(zhǎng)緩慢。當(dāng)溶液中總氮量分別為1.76和5.28 mmol時(shí)，對(duì)應(yīng)生物量產(chǎn)率為10.12和10.55 g·m-2·d-1，與恒定氮濃度1.76 mmol·L-1條件下的結(jié)果相差不大，由于該試驗(yàn)中培養(yǎng)基為循環(huán)利用，因此試驗(yàn)結(jié)果表明，在不明顯影響生物量營(yíng)養(yǎng)鹽的浪費(fèi)，而且也不能進(jìn)一步提高生物量和油脂產(chǎn)量。

圖4 恒定氮濃度對(duì)柵藻細(xì)胞形態(tài)(A：接種時(shí)，B～I(xiàn)：柵藻分別在0、0.18、0.35、0.88、1.76、3.52、8.82和17.65 mmol·L-1恒定氮濃度下培養(yǎng)7 d后)的影響Fig.4 The morphology of S. obliquus under following conditions(A)inoculation(B)-(I)on the 7th day and the nitrate concentrations were 0, 0.18, 0.35, 0.88, 1.76, 3.52, 8.82 and 17.65 mmol·L-1, respectively

圖5 不同總氮量條件下(A)培養(yǎng)基中氮濃度變化以及總氮量對(duì)柵藻(培養(yǎng)7 d)(B)生物量、(C)總脂和(D)TAG 積累的影響Fig.5 (A)Variation of nitrate concentration during 7 days cultivation, the(B)biomass,(C)total lipid and(D)TAG accumulation of S. obliquus under different nitrate quantities after 7 days cultivation

產(chǎn)率的前提下，減少總氮量和用水量是可行的。圖5 C顯示柵藻中的油脂含量與總氮量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，總氮量越少，油脂含量越高，油脂產(chǎn)率會(huì)隨著溶液中總氮量的升高而升高，但當(dāng)總氮量大于0.176 mmol時(shí)，油脂產(chǎn)率上升幅度并不大。圖5 D顯示TAG含量變化與油脂含量變化相似，即隨著總氮量的增加呈下降趨勢(shì)，但這種趨勢(shì)并不十分明顯。而且除了第一組(0.176 mmol)外，TAG產(chǎn)率隨總氮含量的變化也不明顯，大約都在2.3 g·m-2·d-1附近波動(dòng)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，1.76 mmol 的總氮量可以使得160 cm2的微藻貼壁生長(zhǎng)總脂和TAG培養(yǎng)7 d的產(chǎn)率達(dá)到峰值，溶液中過(guò)量的氮不僅造成

柵藻在不同總氮量條件下對(duì)培養(yǎng)液中的氮利用情況見(jiàn)表1。氮利用率(η)為培養(yǎng)7 d后細(xì)胞中的氮含量增量與初始培養(yǎng)基中的氮含量總量的比值，培養(yǎng)基氮損失率(σ)是描述培養(yǎng)基中既沒(méi)有被藻細(xì)胞同化吸收也沒(méi)有在培養(yǎng)基中殘留的參數(shù)。氮利用率和培養(yǎng)基氮損失率計(jì)算公式如下：

η=(Mend×Wend-Mini×Wini)/14/(Cini×V)

(6)

σ=1-η-Cend/Cini

(7)

表1 柵藻在不同總氮量條件下對(duì)氮的利用情況Table 1 The nitrogen utilization property of S. obliquus under different nitrate quantities

其中,Wini和Wend分別為培養(yǎng)開始與結(jié)束時(shí)反應(yīng)器中細(xì)胞總生物量干重/mg，Mini和Mend分別為培養(yǎng)開始與結(jié)束時(shí)細(xì)胞中氮元素占細(xì)胞干重的比例，Cini和Cend分別為培養(yǎng)開始與結(jié)束時(shí)培養(yǎng)基中氮濃度/mmol·L-1，V為培養(yǎng)基體積/L。本試驗(yàn)中Wini、Mini和Cini分別為(150.08±1.13)mg、(9.42%±0.05%)DW和(1.73±0.01)mmol·L-1。

由表1可以看出，溶液中總氮量的變化會(huì)引起藻細(xì)胞中氮含量也發(fā)生變化，在所有試驗(yàn)組中，細(xì)胞中氮含量都有所下降，而且溶液中總氮量越少，下降幅度越大。細(xì)胞中氮含量下降可能是由于細(xì)胞在缺氮環(huán)境下會(huì)消耗自身的氮來(lái)維持生長(zhǎng)或積累代謝產(chǎn)物。當(dāng)溶液中總氮量為0.528 mmol時(shí)，細(xì)胞對(duì)氮的利用率最高，由此說(shuō)明，在一定范圍內(nèi)，溶液中總氮量升高或降低也會(huì)降低細(xì)胞對(duì)氮的利用率，而且所有試驗(yàn)組中都有不同程度的氮損失。

由以上試驗(yàn)可知，1 L含1.76 mmol總氮量的培養(yǎng)基可以足夠支撐160 cm2柵藻貼壁生長(zhǎng)和油脂積累。

3 討論與結(jié)論

氮元素在光合作用中起著至關(guān)重要的作用，參與氨基酸、嘌呤、嘧啶、胺化合物和葉綠素等的合成。對(duì)于光合自養(yǎng)的微藻一般可以利用硝酸鹽、亞硝酸鹽和銨鹽等無(wú)機(jī)鹽作為氮源，氮源的濃度對(duì)微藻的生長(zhǎng)和油脂積累有顯著影響[26]。一般情況下，提高氮源濃度會(huì)促進(jìn)藻類快速生長(zhǎng)積累大量生物量而油脂含量較低，雖然降低氮源濃度不利于生物量的增加，但是卻會(huì)刺激微藻大量積累油脂[27]。鑒于這種情況，很多前期的研究會(huì)采用“兩步法”提高微藻中的油脂產(chǎn)量，具體方法為先將微藻置于合適的氮源且氮源濃度較高的培養(yǎng)基中積累大量生物量，等生物量積累到一定程度再降低培養(yǎng)基中的氮源濃度刺激微藻產(chǎn)油，但是這種方法一般周期較長(zhǎng)，不利于大規(guī)模微藻生物柴油制備。為了縮短產(chǎn)油周期同時(shí)又可以獲得較高的油脂產(chǎn)量，“一步法”即選擇合適的氮濃度使得在不明顯影響微藻生物量的前提下又可以大量積累油脂被廣泛采用，這種方法的可行性和優(yōu)勢(shì)也被許多研究證實(shí)，但是選取合適的氮濃度是這種方法里最關(guān)鍵的因素，需要進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)才能獲取。由本文試驗(yàn)結(jié)果可知，在貼壁條件下，“一步法”產(chǎn)油是可行的，當(dāng)?shù)?NaNO3)濃度為1.76 mmol·L-1時(shí)，柵藻生物量和油脂積累可同時(shí)進(jìn)行，且在該濃度下，柵藻的總脂和TAG產(chǎn)率達(dá)到最大值。

在傳統(tǒng)的微藻液體懸浮式培養(yǎng)模式中耗水量巨大，研究結(jié)果顯示使用開放池系統(tǒng)生產(chǎn)1 kg生物量需要2 857 L水[28]，開放池和平板密閉式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)微藻單位面積需水量分別為300和 100 L·m-2[28]。本文研究結(jié)果證實(shí)微藻在貼壁培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)，在不明顯影響生物量產(chǎn)率的前提下，減少總氮量和用水量是可行的。而且有研究表明微藻貼壁培養(yǎng)的單位面積需水量(60 L·m-2)有望在繼續(xù)優(yōu)化后降低到< 2 L·m-2[29, 30]。

在研究總氮量對(duì)柵藻生物量和油脂積累影響的所有試驗(yàn)組中都有不同程度的氮損失(表1)，其原因可能是濾紙和濾膜中有殘留氮，或者是溶液中存在一些反硝化細(xì)菌等能通過(guò)反硝化作用將溶液里的部分硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氨、氮?dú)饣虻趸锱抛遊31～33]。

本研究證明貼壁培養(yǎng)模式下，培養(yǎng)基中氮元素對(duì)柵藻細(xì)胞生長(zhǎng)有重要影響，生物量積累隨恒定氮濃度的升高而升高，而油脂卻相反，但是在某一特定氮濃度下(1.76 mmol·L-1)油脂產(chǎn)率會(huì)達(dá)到最高值。最佳供氮策略為：在培養(yǎng)基循環(huán)的方式下，60 L氮濃度為1.76 mmol·L-1(為正常BG-11中氮濃度的1/10)的BG-11可使1 m2接種量為10 g·m-2的柵藻的總脂和TAG產(chǎn)率達(dá)到最大，同時(shí)生物量產(chǎn)率也可達(dá)到一個(gè)較高值。這個(gè)策略不僅可以達(dá)到“一步法”產(chǎn)油的目的，而且如果應(yīng)用于多層貼壁培養(yǎng)模式的話，可成倍提高油脂產(chǎn)率。本研究是最終實(shí)現(xiàn)微藻貼壁培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化的重要基礎(chǔ)，能為設(shè)計(jì)和建造高效的、適合規(guī)模生產(chǎn)的貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)和營(yíng)養(yǎng)元素調(diào)控及利用和水耗節(jié)約等方面調(diào)控工藝提供理論支撐。