石甜甜，何杰麗，秦明月，陳凌，王海崗，王瑞云,*，喬治軍*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，山西 太谷 030801； 3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031)

糜子(PanicummiliaceumL.)屬于禾本科黍?qū)?，是地球上最古老的粟類作物之一，為中?guó)古代北方局域重要性主糧[1,2]，也是遠(yuǎn)東地區(qū)(中國(guó)、日本、俄羅斯和印度)的主要糧食作物。在水稻和小麥引入之前，糜子是整個(gè)歐亞大陸的主糧，至今仍然是半干旱地區(qū)的重要作物[3～5]。糜子在歐美各國(guó)主要用于飼?shū)B(niǎo)和禽畜育肥。糜子是C4植物，蒸騰速率低，可以在干旱、高溫等惡劣條件下快速成熟，可作為干旱、半干旱地區(qū)的穩(wěn)產(chǎn)作物。中國(guó)是糜子的起源中心，種質(zhì)資源豐富多彩[6]，研究糜子抗病基因特性可以為抗性品種育種及其高效利用提供理論基礎(chǔ)。

白粉病(powdery mildews)由白粉菌引起，該菌屬于專化活體營(yíng)養(yǎng)寄生菌，分布廣泛，可以侵染大部分糧食作物，阻礙植物生長(zhǎng)發(fā)育，影響糧食產(chǎn)量[7]。作為植物抗病基因中的重要成員，白粉病基因Mlo(Mildewresistancelocuso)最早在大麥中發(fā)現(xiàn)并分離[8,9]。迄今，已經(jīng)在大麥[10]、擬南芥[11]、葡萄[12]和黃瓜[13]中發(fā)現(xiàn)了Mlo基因家族的特異性同源物，并將其用于研究白粉病真菌的發(fā)病機(jī)制。Mlo基因作為植物特有的基因家族，在調(diào)控植物非生物和生物脅迫方面起重要作用。目前，Mlo基因已經(jīng)在大麥等植物中被克隆，并且明確了其分子結(jié)構(gòu)和功能，通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段將其導(dǎo)入其他植物的研究正在展開(kāi)[14]。大麥、擬南芥、番茄等植物中的Mlo型抗病蛋白都由Mlo基因編碼[15]。

研究發(fā)現(xiàn)一些作物的Mlo基因家族成員具有抗白粉病特性，其在高等植物基因組中較小，在單子葉和雙子葉植物中基因數(shù)為8到39個(gè)[16]。Mlo基因的缺失突變對(duì)絕大多數(shù)大麥白粉病菌具有廣譜抗性，對(duì)其他植物的病原菌也具抗性[16， 19,20]。功能喪失型Mlo等位基因由核苷酸的取代、插入、缺失或異常剪接導(dǎo)致[21～24]。Mlo突變體也存在有害的多效性效應(yīng)(如早衰或株高降低)[19]。Mlo位于質(zhì)膜上，包含幾個(gè)跨膜域，研究發(fā)現(xiàn)葉片Mlo與衰老、形態(tài)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)等有關(guān)，但其功能尚不明確[25]。

Mlo基因家族成員具有較強(qiáng)的抗病性，使其越來(lái)越成為育種研究的熱門話題。從育種角度考慮，首要工作就是Mlo基因的發(fā)掘。糜子為小宗糧豆作物，其Mlo基因尚未克隆。為了揭示糜子Mlo基因?qū)Π追鄄〉目剐?，本研究基于前期糜子轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中發(fā)現(xiàn)的一段Mlo基因的cDNA序列為研究對(duì)象，利用一系列生物信息學(xué)方法鑒定與分析Mlo基因編碼蛋白的序列特征，并利用qRT-PCR 技術(shù)評(píng)估了糜子葉片接菌后，Mlo基因表達(dá)量的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為黃糜子(00005272)，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所提供。室內(nèi)種植培育至三葉期，待后續(xù)處理。

1.2 方法

1.2.1 糜子材料處理及總 RNA 提取

糜子葉片白粉病菌的接種采用病葉片壓片法[26]。選取糜子葉長(zhǎng)度約 7.0 cm的幼葉，壓片前預(yù)先噴霧無(wú)菌水使葉片上有微小液滴，但無(wú)明顯露滴出現(xiàn)。采集甜瓜白粉病發(fā)病癥狀嚴(yán)重的感病葉片，對(duì)糜子葉片壓片接種，并在接種后 0、3、6、9、12、15 d 采集葉片液氮凍存。糜子葉片總 RNA 的提取采用Trizol法。

1.2.2 Mlo基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

在NCBI中，利用在線軟件ORF Finder預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框并翻譯蛋白質(zhì)序列、ProtParam預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、SignalP4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列、TMHMM分析跨膜結(jié)構(gòu)、ProtComp和TargetP進(jìn)行亞細(xì)胞定位、NetNES分析核輸出信號(hào)、Phyre2預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、TM HMM-2.0預(yù)測(cè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)、DNAMAN 8.0 和進(jìn)行序列多重比較、MEGA 7.0.21構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、MEME預(yù)測(cè)蛋白的保守結(jié)構(gòu)，各軟件具體網(wǎng)址見(jiàn)何杰麗等[27]。

1.2.3Mlo基因的實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析

采用TRIzon總RNA提取試劑盒(CW0580S)提取不同時(shí)間處理下的黃糜子葉片RNA，并通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。采用PrimeScript? RT Master Mix試劑盒(TaK aRa，大連)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，保存于-20 ℃ 冰箱。用Primer5軟件設(shè)計(jì)特異引物“(F: 5’- CTCAGTCAGCGAGGTTAT-3’，R:5’-ACGAGAACAG ACCATAGC-3’)與內(nèi)參引物ACT(F:5’-ACCGAAGCCCCTCTTAACCC-3’，R：5’-GTAT GGCTGACACC ATCACC-3’)”[28]并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

以 cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系與PCR反應(yīng)程序同何杰麗[27]，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，利用2-△△CT法[29]計(jì)算基因在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)量。在DPS軟件中根據(jù)3次生物學(xué)重復(fù)及3次技術(shù)重復(fù)，利用Duncan多重比較對(duì)不同樣品間差異顯著性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸及氨基酸序列分析

由在線軟件對(duì)糜子Mlo基因進(jìn)行開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，其核酸序列見(jiàn)圖2。由圖1和圖2可以看出，ORF4最長(zhǎng)，cDNA序列包含1 827 bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼609個(gè)氨基酸，5’端有一個(gè)起始密碼子ATG，編碼甲硫氨酸(M)，3’端有一個(gè)終止密碼子 TGA，不編碼氨基酸。

圖1 糜子Mlo基因開(kāi)放閱讀框結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of open reading frame of Mlo gene in common millet

圖2 糜子Mlo蛋白的核苷酸和預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and predicted amino acid sequences of Mlo protein in common millet

2.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

分析Mlo蛋白的理化特性，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，Mlo蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為55.55，屬于不穩(wěn)定蛋白；總平均親水性為0.973，屬于疏水蛋白；Mlo蛋白中，丙氨酸(Ala)含量最高(28.9%)，半胱氨酸(Cys)含量次之(27.9%)，甘氨酸(Gly)和蘇氨酸(Thr)含量分別為19.2%和24.0%。

表1 糜子Mlo蛋白的理化特性Table 1 Physicochemical properties of Mlo protein of common millet

2.3 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)分析

糜子Mlo蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，該蛋白屬于Mlo超基因家族，含有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，保守結(jié)構(gòu)域位于第1～348位氨基酸之間。

圖3 糜子Mlo的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved structural domain of Mlo protein in common millet

2.4 Mlo蛋白信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)分析

分析糜子Mlo蛋白的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖4～圖6。由圖4可知，Y值來(lái)預(yù)測(cè)信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)，通過(guò)S值判斷該蛋白是否為分泌蛋白，若S值大于0.5，則為分泌蛋白，具有信號(hào)肽。結(jié)果表明S值存在于超過(guò)0.5的區(qū)域，故該蛋白為分泌蛋白，具有信號(hào)肽。由圖5可知原子吸收光譜為0.431 43，該蛋白沒(méi)有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。由圖6可知該蛋白存在42位氨基酸到57位氨基酸的跨膜肽鏈，且N-末端在膜外，C-末端在膜內(nèi)。

圖4 糜子Mlo蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.4 Signal peptide prediction of Mlo protein in common millet

圖5 糜子Mlo蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Transmembrane structure analysis of Mlo protein in common millet

圖6 糜子Mlo蛋白跨膜肽鏈分析Fig.6 Transmembrane peptide chain analysis of Mlo protein in common millet

2.5 亞細(xì)胞定位

利用ProtComp在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可以看出，質(zhì)膜位置預(yù)測(cè)值為9.6，說(shuō)明該蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。

圖7 糜子Mlo蛋白亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcell localization of Mlo protein in common millet

2.6 核輸出信號(hào)分析

由圖8可知該蛋白質(zhì)的第38位的異亮氨酸(I)的NES-Score超過(guò)閾值，表明該異亮氨酸為糜子Mlo核輸出信號(hào)。

圖8 糜子Mlo蛋白核輸出信號(hào)預(yù)測(cè)Fig.8 Nuclear output signal prediction of Mlo protein in common millet

2.7 糜子Mlo蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用軟件預(yù)測(cè)Mlo蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖9和圖10。由圖9可知，該蛋白有4個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)和3個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)。由圖10可以看出，該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)也包括4個(gè)α螺旋(紅、橙、綠和青)和3個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)。

圖9 糜子Mlo蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Secondary structure prediction of Mlo in common millet

圖10 糜子Mlo蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 Three-level structure prediction of Mlo in common millet

2.8 Mlo進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

7種植物Mlo蛋白序列的進(jìn)化樹(shù)和多重序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖11和圖12。從圖11和圖12可以看出，糜子與黃瓜Mlo蛋白的序列一致性的為100%，與其他3種葫蘆科植物(西葫蘆、苦瓜和南瓜)的序列一致性超過(guò)80%，而與陸地棉的序列的一致性較低(65%)，與大豆的一致性最低(59%)。

2.9 糜子Mlo基因的表達(dá)特性分析

對(duì)糜子葉片進(jìn)行活體白粉病菌接種，利用實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)每隔3 d檢測(cè)Mlo基因表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖13。從圖13可以看出，糜子Mlo基因mRNA表達(dá)水平在接菌不同時(shí)間后存在差異。糜子葉片接菌后，隨著時(shí)間增加，Mlo基因mRNA相對(duì)表達(dá)量呈先升后降的趨勢(shì)。接種3 d時(shí)，mRNA表達(dá)量?jī)H在0.05水平上顯著高于對(duì)照；接種6、9和12 d時(shí)，mRNA表達(dá)量在0.05和0.01水平上均顯著高于對(duì)照； 9 d時(shí)mRNA表達(dá)量最高，為對(duì)照的4.33倍；15 d時(shí)，mRNA表達(dá)量與對(duì)照相比，差異不顯著。

圖11 7種植物Mlo蛋白氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)Fig.11 Evolutionary tree of amino acid sequence of Mlo in 7 species

圖12 7種植物Mlo蛋白氨基酸序列多重序列比對(duì)結(jié)果Fig.12 Multiple sequences comparison results of Mlo amino acids in 7 species

圖13 糜子葉片Mlo基因表達(dá)水平Fig.13 Expression level of Mlo gene in common millet leave

3 討論與結(jié)論

植物在自身的進(jìn)化演變過(guò)程中形成了一系列復(fù)雜而嚴(yán)密的保護(hù)機(jī)制，以使自身免受病原物侵害，其中涉及一系列抗病相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控[30,31]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白粉菌侵染糜子葉片能夠?qū)е翸lo基因相對(duì)表達(dá)量升高，隨著接菌天數(shù)增加，Mlo基因相對(duì)表達(dá)量呈先增加后降低的趨勢(shì)。9 d時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照的4.33倍，15 d時(shí)與對(duì)照相比，基因表達(dá)量差異不顯著。因此，Mlo基因相對(duì)表達(dá)量與糜子接菌處理后的不同時(shí)間有關(guān)。

夏禮如等[15]以黃瓜的全基因組序列為基礎(chǔ)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法來(lái)研究黃瓜Mlo型基因家族成員，對(duì)其進(jìn)行鑒定及生物信息學(xué)分析，結(jié)果在黃瓜全基因組中鑒定得出14條Mlo型基因序列。徐堅(jiān)等[13]發(fā)現(xiàn)大部分Mlo基因來(lái)源于擬南芥、黃瓜、甜瓜和西瓜，本研究也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，進(jìn)化樹(shù)分析表明糜子和黃瓜的Mlo序列一致性為100%。目前，糜子研究多集中于遺傳多樣性評(píng)估、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等方面[2,5,6,32～34]。近來(lái)，王瑞云對(duì)糜子的遺傳多樣性、栽培馴化和傳播途徑等進(jìn)行了詳細(xì)闡述[33]；Wang等評(píng)估了中國(guó)糜子waxy等位變異的遺傳多樣性，在132份糜子材料中發(fā)現(xiàn)了5種waxy基因型及其所占比例，分別為S-15/LF(45%)、 S0/LF(25%)、 S0/LY(12%)、S0/LC(11%)和S-15/LY(7%)[34]。然而，糜子中已克隆的基因較少，多為抗旱相關(guān)基因，包括PmNCED1和SAMS的克隆，Ty1-copia基因的表達(dá)[1,27,35,36]。白粉病作為作物生產(chǎn)上最重要的病害之一，鑒定白粉病基因是實(shí)現(xiàn)抗病育種的前提。本研究首次分析了糜子Mlo基因編碼蛋白的生物信息學(xué)特性，為抗白粉病基因的克隆及新品系的篩選提供了理論參考。