趙興蕊 劉常遜 楊發(fā)建 王洪云

中圖分類(lèi)號(hào) R284.1；R282.71 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）23-3246-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.17

摘 要 目的：對(duì)重樓藥材原植物黑籽重樓進(jìn)行系統(tǒng)的生藥學(xué)研究。方法：對(duì)黑籽重樓的植物形態(tài)、藥材特征、藥材橫切面及粉末進(jìn)行觀察；以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ為對(duì)照品對(duì)藥材進(jìn)行薄層鑒別，采用高效液相色譜法測(cè)定黑籽重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量。結(jié)果：黑籽重樓的原植物特征包括具有側(cè)膜胎座，果開(kāi)裂，無(wú)外種皮，于一側(cè)包以深紅色多汁的雞冠狀假種皮；查閱文獻(xiàn)，黑籽重樓與云南重樓、七葉一枝花在藥材性狀上的區(qū)別主要表現(xiàn)在表面顏色、形狀、環(huán)紋、斷面上，氣味上沒(méi)有明顯的差異；黑籽重樓的橫切面結(jié)構(gòu)、粉末特征與云南重樓、七葉一枝花沒(méi)有明顯差異；經(jīng)薄層色譜鑒別，在黑籽重樓根莖中都含有重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ，含量分別為0.117%、0.081%、0.114%、0.204%；重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量為0.516%，與藥典標(biāo)準(zhǔn)（含重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量不得少于0.60%）存在差異。結(jié)論：本研究可為黑籽重樓的鑒定及進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 黑籽重樓；性狀鑒別；顯微鑒別；理化鑒別；高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： Conduct a systematic pharmacognostical study on herbs of Paris thibetica Franch. METHODS： The plant morphology of Paris thibetica Franch， characteristics， cross section and powder were all observed. The polyphyllin Ⅰ， Ⅱ， Ⅵ and Ⅶ were used as reference substance for TLC. HPLC method was used to determine the contents of polyphyllin Ⅰ， Ⅱ， Ⅵ and Ⅶ in Paris thibetica Franch. RESULTS： The original plant characteristic of Paris thibetica Franch was the lateral membrane placenta， the fruits were cracked without outer seed coat， a dark red juicy cockatoo aril was wrapped on one side. After literature review， the character differences of Paris polyphylla Smith var. yunnanensis （Franch.） Hand.-Mazz. and Paris polyphylla Smith var. chinensis （Franch.） Hara were mainly manifested in the surface color， shape， ring pattern and cross section， but there was no obvious difference in odor. There was no significant difference in the transverse section structure and powder characteristics of P. polyphylla Smith var. Yunnanensis （Franch.） Hand. Mazz and P. polyphylla Smith var. chinensis （Franch.） Hara. TLC identification showed that polyphyllin Ⅰ， Ⅱ， Ⅵ and Ⅶ were all found in Paris thibetica Franch， the contents were 0.117%， 0.081%， 0.114%， 0.204%， respectively. Total content of polyphyllin Ⅰ， Ⅱ， Ⅵ and Ⅶ was 0.516%， which was different from the standard value of China Pharmacopoeia （total content of them was no less than 0.60%）. CONCLUSIONS： This study can provide scientific basis for the identification and further research of Paris thibetica Franch.

KEYWORDS Paris thibetica Franch； Characteristics identification； Microscopic identification； Physicochemical identification； HPLC

重樓屬植物全世界共有24個(gè)種，我國(guó)有7種和8變種[1]。重樓始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，以其根莖入藥，具有清熱解毒、消腫止痛和熄風(fēng)定驚之功效[2]，是云南白藥、宮血寧膠囊等多種中成藥的主要組成藥材[3]。現(xiàn)代研究表明，重樓具有抗腫瘤、抗菌、消炎、止血、止渴、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等藥理作用[4]。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）收載的重樓屬植物只有云南重樓、七葉一枝花[5]，但藥材需求量大導(dǎo)致供不應(yīng)求，植物被大量采挖，資源匱乏日益突出[6]，而該屬植物絕大多數(shù)種類(lèi)在不同地區(qū)均供藥用[7]。

黑籽重樓（Paris thibetica Franch）是重樓屬多年生草本植物，主要分布于我國(guó)的西藏東南部、云南西北部、四川、甘肅南部、貴州以及不丹和錫金[8]。黑籽重樓以根莖入藥，具有清熱解毒、消腫止痛的功效[9]，該種在民間主要作為重樓藥材使用。目前藥材市場(chǎng)上重樓屬藥用植物有毛重樓、南重樓、黑籽重樓等18個(gè)重樓屬植物作為藥用植物在利用[10]。文獻(xiàn)報(bào)道[11]，黑籽重樓根莖的主要化學(xué)成分是甾體皂苷類(lèi)化合物，與云南重樓和七葉一枝花化學(xué)成分類(lèi)似，并且化學(xué)成分中苷元3位連接糖鏈的甾體皂苷類(lèi)化合物具有良好的抗腫瘤活性，對(duì)人肝癌Bel-7402細(xì)胞有細(xì)胞毒活性，一定程度上證明了黑籽重樓具有作為重樓替代藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)。另外，李青等[12]研究不同產(chǎn)地的13個(gè)黑籽重樓樣品中10種重樓皂苷的含量發(fā)現(xiàn)，從崇州采集的黑籽重樓樣品，重樓總皂苷含量高于其他產(chǎn)地，且重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量之和與其他產(chǎn)地的樣品比較也相對(duì)較高?，F(xiàn)筆者對(duì)黑籽重樓的根莖部分進(jìn)行生藥學(xué)研究，希望此研究結(jié)果能有利于加強(qiáng)對(duì)其的鑒別，也能為合理開(kāi)發(fā)、利用和擴(kuò)大重樓屬植物的藥用資源提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

BX51顯微鏡（日本Olympus公司）；GoodLook-2000薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆籛aters2695高效液相色譜儀，包括G1311A四元梯度泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G2170BA色譜工作站、G1314A紫外檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

試驗(yàn)藥材于2017年采自于保山地區(qū)，樣品編號(hào)分別為20170503、20170619、20170706，經(jīng)楊發(fā)建講師鑒定為百合科重樓屬植物黑籽重樓（Paris thibetica Franch）的根莖。重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對(duì)照品（批號(hào)：分別為CLZI20160517、CLZII20151102、CLZVI20150715、CLVII20161021，純度：≥98%，購(gòu)于南京春秋生物工程有限公司）；重樓對(duì)照藥材（來(lái)源于百合科植物云南重樓的根莖，批號(hào)：CLYC20160123，購(gòu)于南京春秋生物工程有限公司）；乙腈為色譜純，水為純化水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 植物形態(tài)鑒別

通過(guò)觀察植物器官形態(tài)，描述出植物形態(tài)。黑籽重樓為多年生草本，莖綠色，有時(shí)帶紫色，無(wú)毛，高20～47 cm；葉7～12枚或8～12枚，綠色，背稍淡，無(wú)毛，線形、線狀長(zhǎng)圓形或披針形，先端長(zhǎng)漸尖，基部楔形，長(zhǎng)6.5～15 cm，寬1～1.6 cm，通常無(wú)柄，或具長(zhǎng)約僅2～3 mm的短柄。花梗長(zhǎng)3.5～11 cm，果期伸長(zhǎng)幅度不大，但從基部外折；花基數(shù)4～5個(gè)或4～7個(gè)，遠(yuǎn)小于葉數(shù)；萼片綠色，線狀披針形、披針形，長(zhǎng)3.5～8 cm，寬1～1.8 cm，伸展，平伸或稍下彎；花瓣淡綠色，絲狀，斜伸，比萼片短，長(zhǎng)3～5.8 cm；雄蕊2輪，幾乎沒(méi)有例外，全長(zhǎng)18～49 mm；花絲淡綠色，長(zhǎng)5～10 mm；花藥長(zhǎng)8～15 mm，藥隔突出部分很長(zhǎng)，淡綠色，長(zhǎng)8～27 mm；子房長(zhǎng)圓錐形，綠色，明顯具棱1 室；側(cè)膜胎座4～5個(gè)或4～7個(gè)，胚珠多數(shù)，白色；花柱基紫色，花柱長(zhǎng)僅0～1 mm，柱頭綠色，長(zhǎng)3～7 mm，星狀平展。果近球形，直徑0.7～1.5 cm，果皮薄，棱翅不明顯，從頂部不規(guī)則開(kāi)裂。種子多數(shù)，卵形，長(zhǎng)2～3 mm，直徑2～2.5 mm，亮黑色，光滑，堅(jiān)硬，于一側(cè)包以深紅色多汁的雞冠狀假種皮。花期4月，果6月開(kāi)裂，為開(kāi)花較早而果成熟最快的一種[13]。黑籽重樓的植物形態(tài)見(jiàn)圖1。

2.2 性狀鑒別

觀察自然干燥的根莖，描述藥材的表面、質(zhì)地及斷面特征，黑籽重樓根莖粗細(xì)不規(guī)則，幼齡根莖纖細(xì)，俗稱(chēng)“螞蟥重樓”[9]。根莖呈結(jié)節(jié)狀扁圓柱形，略彎曲，根莖長(zhǎng)5～12 cm，粗0.8～3 cm，表面黃褐色，內(nèi)切面白色，有層狀突起的環(huán)紋，節(jié)較疏，多環(huán)節(jié)，結(jié)節(jié)上可見(jiàn)凹陷的莖痕及須根，頂端殘留有莖基和鱗葉。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，斷面平坦，粉性或角質(zhì)，呈白色或淺棕黃色。氣微，味微苦、麻。黑籽重樓的根莖干燥品形態(tài)見(jiàn)圖2。

2.3 顯微鑒別

2.3.1 根莖橫切面顯微鑒別 取黑籽重樓根莖制作石蠟切片，采用生物組織自動(dòng)脫水機(jī)脫水、生物組織冷凍、包埋機(jī)包埋、生物組織切片機(jī)切片、染色、干燥、檢視，在顯微鏡下觀察組織特征。結(jié)果，根莖表皮細(xì)胞1列，不規(guī)則，類(lèi)圓形或類(lèi)長(zhǎng)方形，外壁較厚，排列緊密，脊線較密。皮層較中柱寬，細(xì)胞不規(guī)則形或類(lèi)圓形，細(xì)胞中充滿(mǎn)淀粉粒，薄壁細(xì)胞間散有多數(shù)大的黏液細(xì)胞，內(nèi)含草酸鈣針晶束，皮層中可見(jiàn)葉跡維管束和根跡維管束。內(nèi)皮層不明顯。維管束呈散狀排列，大多為周木型維管束，為不規(guī)則形或類(lèi)三角形，木質(zhì)部細(xì)胞大，內(nèi)分布有導(dǎo)管，呈斷續(xù)或連續(xù)環(huán)列于韌皮部的四周，韌皮部細(xì)胞小，排列緊密。黑籽重樓根莖橫切面顯微特征見(jiàn)圖3。

2.3.2 根莖粉末顯微鑒別 將自然干燥根莖粉碎后過(guò)80目篩的粉末，取少許粉末放于載玻片上，滴加水合氯醛溶液，于酒精燈外焰處加熱透化，反復(fù)透化3次，再滴加稀甘油溶液，封片，觀察細(xì)胞特征。另取少許粉末于另一個(gè)載玻片上，滴加稀甘油溶液，封片，觀察淀粉粒，在顯微鏡下觀察粉末特征。結(jié)果，根莖粉末為淺灰白色。淀粉粒眾多，多數(shù)為單粒，呈類(lèi)圓形、橢圓形，臍點(diǎn)為點(diǎn)狀、星狀或一字形、人字形，直徑為2.82～18.75 μm；少數(shù)為復(fù)粒，常由2～3個(gè)分粒組成；草酸鈣針晶多呈束狀存在，少數(shù)散狀分布，長(zhǎng)35～137.48 μm。薄壁細(xì)胞類(lèi)長(zhǎng)圓形或不規(guī)則形，內(nèi)富含淀粉粒。可見(jiàn)螺紋、梯紋導(dǎo)管，直徑為11.93～25.98 μm。黑籽重樓根莖粉末顯微特征見(jiàn)圖4。

2.4 薄層檢識(shí)

分別取黑籽重樓及云南重樓對(duì)照藥材粉末0.5 g于圓底燒瓶中，加乙醇10 mL，加熱回流30 min，濾液作為供試品溶液；另取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL各含0.8 mg的單溶液及混合溶液作為對(duì)照品溶液，按2015年版《中國(guó)藥典》（一部）附錄ⅥB薄層色譜法試驗(yàn)，分別取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5 ?L，分別點(diǎn)樣于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（15 ∶ 5 ∶ 1，V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。結(jié)果，在紫外光（365 nm）下，供試品溶液與重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上出現(xiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，說(shuō)明黑籽重樓中含有重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ這4種成分。黑籽重樓的薄層色譜圖見(jiàn)圖5。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～40 min， 30%→60%A；40～50 min， 60%→30%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 ?L。

2.5.2 溶液的制備 （1）混合對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的對(duì)照品適量，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.46、0.40、0.52、0.48 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，混勻，置于冰箱中（4 ℃）保存，備用。（2）供試品溶液。取黑籽重樓的粉末約0.5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞圓底燒瓶中，加入乙醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.5.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.5.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，在該色譜條件下，各待測(cè)成分間、待測(cè)成分與雜質(zhì)峰間均能達(dá)到基線分離要求，分離度>1.5，理論板數(shù)按重樓皂苷Ⅰ計(jì)不低于5 000。高效液相色譜圖見(jiàn)圖6。

2.5.4 線性關(guān)系考察 取“2.5.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液 0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 mL，加入甲醇溶液定容至1 mL，混勻后按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.5.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ峰面積的RSD分別為0.71%、1.06%、0.87%、1.25%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.5.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20170706），分別于室溫下放置2、4、6、8、10、24 h時(shí)按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ峰面積的RSD分別為1.67%、1.70%、1.67%、1.75%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密量取6份供試品溶液（批號(hào)：20170706），每份1 mL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ峰面積的RSD分別為1.84%、1.41%、1.10%、1.10%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收試驗(yàn) 精確量取6份供試品溶液（批號(hào)：20170706），每份1 mL，分別加入“2.5.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5 mL，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的平均回收率分別為98.23%、99.32%、97.46%、97.86%，RSD分別為1.63%、1.37%、1.89%、1.92%（n=6），表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5.9 樣品含量測(cè)定 取3批樣品各適量，分別按“2.5.2”（2）項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6 結(jié)果

經(jīng)查閱文獻(xiàn)[14]，黑籽重樓與其他種的特征區(qū)別主要有以下幾點(diǎn)：（1）植物形態(tài)。黑籽重樓的原植物特征包括具有側(cè)膜胎座，果開(kāi)裂，無(wú)外種皮，于一側(cè)包以深紅色多汁的雞冠狀假種皮；黑籽重樓與長(zhǎng)柱重樓、毛重樓、云南重樓、七葉一枝花在植物形態(tài)上的區(qū)別，主要表現(xiàn)在胎座的類(lèi)型、果是否開(kāi)裂、有無(wú)外種皮、葉是否有毛、花瓣的形狀等方面。（2）藥材性狀特征。黑籽重樓與云南重樓、七葉一枝花在藥材性狀上的區(qū)別主要表現(xiàn)在表面顏色、形狀、環(huán)紋、斷面上，氣味上沒(méi)有明顯的差異。（3）顯微特征。黑籽重樓的橫切面結(jié)構(gòu)、粉末特征與云南重樓、七葉一枝花沒(méi)有明顯差異。（4）化學(xué)成分定性與定量分析。經(jīng)薄層色譜鑒別，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ這4種成分在黑籽重樓根莖中都有，且含量分別為0.117%、0.081%、0.114%、0.204%。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定的含重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量不得少于0.60%的限量標(biāo)準(zhǔn)[4]，本文研究的黑籽重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量為0.516%，與藥典標(biāo)準(zhǔn)（總量不得少于0.60%）存在差異。

3 討論

通過(guò)對(duì)中藥的大力研究，生藥學(xué)在我國(guó)有了長(zhǎng)遠(yuǎn)的發(fā)展，生藥學(xué)對(duì)于準(zhǔn)確識(shí)別、鑒定中藥基源的種類(lèi)，調(diào)查、考證中藥的資源起到了極大地推進(jìn)作用[15]。通過(guò)對(duì)黑籽重樓系統(tǒng)的生藥學(xué)研究，可為黑籽重樓的鑒定及進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。查閱文獻(xiàn)[16]得知，重樓對(duì)土壤中不同營(yíng)養(yǎng)成分具有選擇性，在富饒的土壤中，速效磷和速效鉀的供應(yīng)有利于重樓根莖中總皂苷和總多糖的合成與積累，說(shuō)明土壤營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)重樓屬植物根莖主要活性成分的含量高低存在一定的影響，不同的產(chǎn)地、不同的土壤，重樓屬植物根莖的活性成分是存在差異的。所以，在栽培過(guò)程中可根據(jù)重樓屬植物的需肥特性及生長(zhǎng)規(guī)律有針對(duì)性地合理施肥，從而使其根莖的品質(zhì)達(dá)到最佳水平。

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（收稿日期：2018-06-28 修回日期：2018-09-26）

（編輯：余慶華）