聶淑科 馬凱 陳貴勤 張振濤 曹學(xué)兵

帕金森病(Parkinson diseases，PD)是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，α-synuclein的異常磷酸化和折疊聚集是PD的核心發(fā)病機(jī)制[1]。α-共核蛋白病理和tau蛋白病理現(xiàn)象可存在于同一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病中，PD患者腦中可發(fā)現(xiàn)tau蛋白過度磷酸化折疊聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)，阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)患者腦中也可發(fā)現(xiàn)磷酸化α-synuclein(S129)〔以下簡(jiǎn)稱為：p-α-syn(S129)〕的異常聚集[2]。p-α-syn(S129)可促進(jìn)tau蛋白的異常折疊和聚集，越來越多的研究表明異常蛋白聚集存在共同致病機(jī)制及相互作用[3-5]。

天冬酰胺內(nèi)切酶(asparagine endopeptidase，AEP)激活并特異性切割tau蛋白產(chǎn)生致病性的tauN368片段是新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)變性疾病病理現(xiàn)象和致病機(jī)制[6-7]。PD患者腦內(nèi)同樣存在AD樣的病理改變(如NFTs)，tau蛋白毒性片段tauN368參與了NFTs形成，作者推測(cè)tau蛋白的致病片段可能也存在PD模型中。本研究通過建立慢性MPTP小鼠PD模型、魚藤酮小鼠PD模型及魚藤酮大鼠PD模型3種經(jīng)典PD動(dòng)物模型，觀察不同PD模型黑質(zhì)、紋狀體及海馬p-α-syn(S129)和tauN368的表達(dá)差異，旨在為研究PD的病理生理機(jī)制提供新的思路。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取雄性C57/BL6小鼠40只，8～9周齡；雄性SD大鼠20只，4～8周齡，體重150～180 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自武漢華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(中國(guó))，SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，喂養(yǎng)溫度維持在21～23℃，12 h晝夜交替，均采用自由進(jìn)食和飲水。本研究經(jīng)華中科技大學(xué)動(dòng)物保護(hù)機(jī)構(gòu)和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2主要材料和儀器1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)、魚藤酮購(gòu)自Sigma公司。MPTP配置方法如下：將10 mg MPTP溶于4 mL生理鹽水配成2.5 mg/mL溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。DAB顯色劑購(gòu)自DAKO公司(K5007)，免疫組化所需其他試劑購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司，免疫熒光DAPI、抗熒光猝滅封片劑購(gòu)自碧云天公司。兔抗酪氨酸羥化酶抗體購(gòu)自Abcam公司，兔抗p-α-syn(Ser129)抗體購(gòu)自Genetex公司， 兔抗tauN368抗體由Emory大學(xué)葉克強(qiáng)教授贈(zèng)送，兔抗β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢安特捷生物科技有限公司，熒光羊抗鼠二抗購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.3方法

1.3.1 MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型：將20只C57/BL6小鼠隨機(jī)分為MPTP小鼠PD模型組(n=10)和對(duì)照組MPTP小鼠(n=10)。模型組按體重25 mg/(kg·d)給予MPTP背部皮下注射，每周2次，共5周；對(duì)照組MPTP小鼠按同法給予等量生理鹽水注射，5周后處死小鼠待檢。

1.3.2 魚藤酮誘導(dǎo)的小鼠PD模型：將20只C57/BL6小鼠隨機(jī)分為魚藤酮小鼠PD模型組(n=10)和對(duì)照組魚藤酮小鼠(n=10)。模型組按體重1 mg/(kg·d)給予魚藤酮(魚藤酮∶DMSO∶生理鹽水=1 mg∶3.5 mL∶0.5 mL)背部皮下注射，連續(xù)50 d；對(duì)照組魚藤酮小鼠給予等量溶媒(DMSO和生理鹽水)背部皮下注射。50 d后處死小鼠待檢。

1.3.3 魚藤酮誘導(dǎo)的大鼠PD模型：將24只SD大鼠隨機(jī)分為魚藤酮大鼠PD模型組(n=10) 和對(duì)照組魚藤酮大鼠(n=10)。模型組按體重1.5 mg/(kg·d)給予魚藤酮(魚藤酮∶DMSO∶玉米油=30 mg∶1 mL∶14 mL)背部皮下注射，連續(xù)5周。對(duì)照組魚藤酮大鼠給予等量溶媒(DMSO和玉米油)注射。35 d后處死大鼠待檢。

1.3.4 腦標(biāo)本制備：采用7%(體積分?jǐn)?shù))水合氯醛按體重0.5 mL/100 g注射麻醉動(dòng)物，切開胸腔，經(jīng)左心室心尖部插入灌流針頭至主動(dòng)脈，切開右心耳排血，生理鹽水持續(xù)沖洗至肝臟顏色變白，滴灌4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛，灌流完畢后斷頭取腦，使用瑞沃德小動(dòng)物腦槽切取所需腦組織塊后放入4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛中4℃固定24 h后脫水、浸蠟、包埋、切片，進(jìn)行免疫組化及免疫熒光檢測(cè)。

1.3.5 免疫組化及熒光染色：將石蠟切片烤片后依次放入二甲苯、濃度梯度無水乙醇脫蠟3～5 min，自來水沖洗5 min，3%(體積分?jǐn)?shù))雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液熱修復(fù)20 min，室溫封閉1 h后一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌后二抗室溫孵育2 h。免疫組化染色采用DAB顯色，蘇木素復(fù)染1 min，梯度脫水及透明后封片。免疫熒光則使用熒光二抗避光濕盒室溫孵育2 h，DAPI染核，采用抗熒光淬滅封片劑對(duì)各切片進(jìn)行封片。生物學(xué)和熒光顯微鏡采集中腦黑質(zhì)區(qū)域酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性神經(jīng)元圖像，采用Image J進(jìn)行圖像采集分析中腦黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目。

1.3.6 Western blot：提取各模型組動(dòng)物黑質(zhì)、紋狀體和海馬總蛋白，變性后分裝于-80℃凍存。配制分離膠和濃縮膠，每孔上樣40 μg，100 V條件下電泳至Marker條帶達(dá)到所需后停止電泳，200 mA條件下轉(zhuǎn)膜70 min，5%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗滌條帶后加入所需的一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次后二抗室溫孵育2 h，Millipore發(fā)光顯影液顯影3 min，Bio-Rad 成像系統(tǒng)顯像，使用Image J軟件計(jì)算分析Western blot條帶灰度值，分析各模型鼠腦區(qū)p-α-syn(S129)和tauN368表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組PD模型黑質(zhì)多巴胺能損傷情況(1)MPTP小鼠PD模型組中腦黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯少于對(duì)照組MPTP小鼠(38.170±7.931比92.576±10.267；t=7.662，P<0.01)。(2)魚藤酮小鼠PD模型組中腦黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目少于對(duì)照組魚藤酮小鼠(40.17±6.931比125.67±16.009，t=5.609，P<0.01)。(3)魚藤酮大鼠PD模型組黑質(zhì)致密部TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目少于對(duì)照組魚藤酮小鼠(80.170±18.931比122.576±10.267，t=4.089，P<0.01)。結(jié)果見圖1～2。

2.2各組模型不同腦區(qū)p-α-syn(S129)和TauN368表達(dá)

2.2.1 MPTP小鼠PD模型：與對(duì)照組MPTP小鼠相比較，MPTP小鼠PD模型黑質(zhì)、紋狀體及海馬tauN368表達(dá)均升高(t黑質(zhì)=3.709，P=0.002；t紋狀體=3.137，P=0.006；t海馬=2.298，P=0.035)，紋狀體p-α-syn(S129)表達(dá)水平升高(t紋狀體=5.492，P<0.01)，而黑質(zhì)和海馬p-α-syn(S129)表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t黑質(zhì)=0.510，P=0.617；t海馬=-0.373，P=0.714)。結(jié)果見圖3、4。

注：PD：帕金森病，圖2～8同；TH：酪氨酸羥化酶，圖2同；MPTP：1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶，圖3、4同；A：對(duì)照組MPTP小鼠；B：MPTP小鼠PD模型組；C：對(duì)照組魚藤酮大鼠；D：魚藤酮大鼠PD模型組 圖1 各組PD模型中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元TH陽(yáng)性神經(jīng)元比較(免疫組化，比例尺=100 μm)

注：A：對(duì)照組；B：魚藤酮小鼠PD模型 圖2 兩組小鼠中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元TH陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞比較(免疫熒光染色，TH/DADI，比例尺=100 μm)

2.2.2 魚藤酮小鼠PD模型：與對(duì)照組魚藤酮小鼠比較，魚藤酮小鼠PD模型組黑質(zhì)及紋狀體p-α-syn(S129)和tauN368表達(dá)均升高(t黑質(zhì)p-a-syn=5.855，P<0.01；t紋狀體p-a-syn=5.718，P<0.01；t黑質(zhì)tauN368=2.348，P=0.032；t紋狀體tauN368=5.280，P<0.01)，而海馬p-α-syn(S129)和tauN368表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)改變(t海馬p-a-syn=-0.256，P=0.801；t海馬tauN368=-0.529，P=0.604)。結(jié)果見圖5、6。

2.2.3 魚藤酮大鼠PD模型：與對(duì)照組魚藤酮大鼠比較，魚藤酮大鼠PD模型黑質(zhì)、紋狀體及海馬p-α-syn(S129)表達(dá)升高(t黑質(zhì)=2.901，P=0.010；t紋狀體=4.916，P<0.01；t海馬=2.352，P=0.032)，紋狀體tauN368表達(dá)水平升高(t紋狀體=8.486，P<0.01)，而黑質(zhì)和海馬tauN368表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t黑質(zhì)=0.885，P=0.389；t海馬=1.314，P=0.207)。結(jié)果見圖7、8。

3 討論

tau蛋白可被AEP和caspase等酶切割截?cái)酁槭セ钚缘钠?，更加容易形成二聚體。Day等[8]在血管性癡呆患者腦尸檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)caspase切割的tau蛋白片段tau C3與NFTs存在共表達(dá)現(xiàn)象。對(duì)AD患者尸檢研究發(fā)現(xiàn)，tau的截?cái)喱F(xiàn)象參與了AD腦內(nèi)NFT的形成過程，而在體外實(shí)驗(yàn)中，tau蛋白的截?cái)嗥慰纱龠M(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[9-11]。

注：p-α-syn(S129)：磷酸化α-synuclein(S129)，圖4～8同 圖3 兩組小鼠不同腦區(qū)p-α-syn(S129)和tauN368表達(dá)電泳圖(Western blot)

注：aP<0.05；bP<0.01 圖4 兩組小鼠不同腦區(qū)p-α-syn(S129)和tauN368表達(dá)比較(Western blot)

圖5 兩組小鼠不同腦區(qū)p-α-syn (S129)和tauN368表達(dá)電泳圖(Western blot)

注：aP<0.05；bP<0.01 圖6 兩組小鼠不同腦組織中p-α-syn(S129)和tauN368表達(dá)比較(Western blot)

圖7 兩組大鼠不同腦組織p-α-syn(S129)和tauN368表達(dá)電泳圖(Western blot)

注：aP<0.05；bP<0.01 圖8 兩組大鼠不同腦組織p-α-syn(S129)和tauN368表達(dá)比較(Western blot)

PD中同樣存在類AD樣的病理改變?nèi)绂碌矸蹣拥鞍装邏K和tau蛋白過度磷酸化形成的NFTs，作者推測(cè)tau蛋白的切割現(xiàn)象可能也存在PD中。本研究結(jié)果顯示，3種不同PD模型鼠黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元大量丟失，黑質(zhì)部位存在不同程度的tauN368和p-α-syn表達(dá)。結(jié)合國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)tau蛋白的異常切割片段具有神經(jīng)毒性作用[6]這一結(jié)論，提示tau蛋白毒性片段可能參與了PD的發(fā)生和發(fā)展。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，MPTP誘導(dǎo)PD小鼠模型黑質(zhì)、紋狀體和海馬tauN368表達(dá)均較對(duì)照組增多，魚藤酮誘導(dǎo)的大鼠PD模型黑質(zhì)和紋狀體tauN368表達(dá)均升高，進(jìn)一步驗(yàn)證作者的推測(cè)，其具體的致病機(jī)制需進(jìn)一步研究。

有研究發(fā)現(xiàn)，通過給予小鼠皮下植入微泵注射魚藤酮制備PD模型，按體重2.2～2.5 mg(kg·d)連續(xù)給藥28 d，模型組小鼠中腦黑質(zhì)、紋狀體α-syn異常聚集及tau蛋白磷酸化較對(duì)照組明顯增多，且tau蛋白的磷酸化程度更為顯著[12]。而采用按體重20 mg(kg·d)連續(xù)5 d皮下注射MPTP，可選擇性引起tau Ser396/404位點(diǎn)磷酸化水平增加，不改變ser202位點(diǎn)的磷酸化水平，這種表達(dá)變化高度依賴α-syn的作用，在α-syn基因敲除小鼠中未發(fā)現(xiàn)MPTP誘導(dǎo)的tau蛋白磷酸化改變[13]。本研究通過比較慢性MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型和魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠和小鼠模型黑質(zhì)、紋狀體及海馬部位p-α-syn(S129)及tauN368的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)3種PD動(dòng)物模型中均存在不同部位及不同水平的p-α-syn(S129)及tauN368表達(dá)增多現(xiàn)象；與魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠和小鼠模型相比，慢性MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型黑質(zhì)和海馬p-α-syn(S129)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)變化，提示慢性MPTP誘導(dǎo)的PD模型并不能完全模擬PD的病理發(fā)展過程，而魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型則能夠在多個(gè)腦區(qū)增加病理性α-syn的表達(dá)。

張如意等[14]研究發(fā)現(xiàn)，給予Lewis大鼠皮下注射不同劑量魚藤酮〔1.0、1.5、2.0 mg(kg·d)〕28 d后評(píng)估PD大鼠模型的運(yùn)動(dòng)功能障礙和紋狀體多巴胺水平，結(jié)果提示1.5 mg(kg·d)劑量造模時(shí)，大鼠可出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)減少，死亡率相對(duì)較低，是建立PD大鼠模型的合適劑量。Sherer 等[12]采用皮下植入微泵的方法給予Lewis大鼠魚藤酮造模，結(jié)果顯示魚藤酮2.0 mg/(kg·d)注射15 d和3.0 mg/ mg/(kg·d)注射21 d組黑質(zhì)、紋狀體多巴胺能神經(jīng)元和神經(jīng)纖維丟失較2.75 mg/(kg·d)注射7 d和3.0 mg/(kg·d)注射32 d組增加。Cannon等[15]將Lweis大鼠分為年輕組(3個(gè)月)、成年組(7個(gè)月)、中年組(12～14個(gè)月)，分別采用2.75、3.00 mg/(kg·d)2個(gè)不同劑量魚藤酮，給藥時(shí)間為7～9 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第9天成年組大鼠3.00 mg/(kg·d)具有明顯的多巴胺神經(jīng)毒性損傷作用。作者前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3.0 mg/(kg·d)魚藤酮造模劑量死亡率極高，SD大鼠1周內(nèi)死亡率達(dá)80%左右，為構(gòu)建慢性PD模型及成功誘導(dǎo)α-syn的聚集，結(jié)合國(guó)內(nèi)研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)選擇1.5 mg/(kg·d)魚藤酮造模劑量，造模時(shí)間選擇35 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)魚藤酮誘導(dǎo)的大鼠PD模型黑質(zhì)、紋狀體和海馬p-α-syn (S129)表達(dá)均較對(duì)照組增加，而紋狀體和海馬組織中tauN368的表達(dá)雖然較對(duì)照組增多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與魚藤酮大鼠PD模型造模時(shí)皮下注射劑量有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型中黑質(zhì)、紋狀體及海馬tauN368表達(dá)較對(duì)照組增高，而在PD病理改變發(fā)生的關(guān)鍵位置黑質(zhì)中p-α-syn (S129)表達(dá)卻未見統(tǒng)計(jì)學(xué)變化，進(jìn)一步肯定了慢性魚藤酮皮下注射可以作為構(gòu)建PD動(dòng)物模型的理想造模藥物。魚藤酮誘導(dǎo)的小鼠PD模型黑質(zhì)和紋狀體同時(shí)存在tauN368和p-α-syn (S129) 表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，該模型是研究PD發(fā)病中tauN368和α-syn相互作用機(jī)制的理想動(dòng)物模型。