杜通 楊春林 李亨 張民 劉儒濤 岳龍濤 李曉麗

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種由乙酰膽堿受體(acytylcholine receptor，AChR)抗體介導、細胞免疫依賴及補體參與的、累及神經(jīng)-肌肉接頭突觸后膜上AChR的自身免疫性疾病。外泌體(exosomes)可由樹突細胞(DCs)、T淋巴細胞、B淋巴細胞、腫瘤細胞等多種細胞分泌而來，可攜帶其來源細胞的成份。DCs源性外泌體穩(wěn)定、易保存，可作為一種免疫干預手段來治療免疫性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，自然殺傷(natural killer，NK)細胞和NK T細胞在抗腫瘤免疫、保護性免疫應答及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[1-2]。NK細胞及NK T細胞在自身免疫性疾病的中作用目前尚不完全明確，尤其是其在MG/實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)中還存在一定爭議。本研究探討了他汀類藥物誘導的髓源樹突細胞(BMDCs)源性外泌體是否能夠通過影響NK細胞和NK T細胞來發(fā)揮其對EAMG的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物雌性Lewis大鼠10只，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，6～8 周齡，體質(zhì)量140～160 g，在SPF級動物房條件下飼養(yǎng)。

1.2主要試劑人工合成的大鼠來源的AChR α亞基97-116(R97-116)肽段(DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI)，購自西安聯(lián)美生物科技有限公司；阿托伐他汀由北京嘉林藥業(yè)股份有限公司提供；重組大鼠粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(rrGM-CSF)和重組大鼠白細胞介素4(rrIL-4)購自美國Peprotech 公司；H37Ra結(jié)核桿菌購自美國Difco公司；不完全福氏佐劑、二甲基亞砜、MEM均購自美國Sigma-Aldrich公司；PE標記的抗大鼠CD3抗體、FITC標記的抗大鼠CD161a抗體和抗大鼠干擾素γ(IFN-γ)抗體購自BioLegend公司；PE標記的抗大鼠白細胞介素10(IL-10)抗體購自Pharmingen公司；RPMI1640購自北京HyClone公司；胎牛血清(FCS)購自美國Gibco公司。

1.3方法

1.3.1 EAMG模型制備：取人工合成的大鼠來源的R97-116肽段溶于H37Ra株熱滅活結(jié)核桿菌和不完全福氏佐劑中，雙后足墊皮下注射免疫大鼠，每只大鼠用量為200 μL[3]。免疫當天記為0 d，免疫后第11天于大鼠背部脊柱兩側(cè)皮下強化免疫1次。從免疫當天至發(fā)病高峰期(免疫后第42天)，采用雙盲法隔天稱重并觀察大鼠癥狀。肌力測量采用Lennon評分標準。輕度肌無力者給予疲勞試驗，即讓大鼠重復抓握籠頂30 s后再測量肌力。具體分級如下：0級，正常肌力；1級，活動輕度減少，抓握力或叫聲減弱，尤其在重復抓握后更加明顯；2級，抓握前即出現(xiàn)震顫、低頭、隆背、抓握力弱；3級，抓握前即有嚴重的肌無力表現(xiàn)，無力抓握，頻死狀態(tài)；4級，死亡。

1.3.2 BMDCs制備及表型分析：無菌條件下取發(fā)病初期EAMG大鼠的股骨和脛骨(n=10)，用無菌PBS沖洗髓腔，然后在無菌濾網(wǎng)上進行研磨制備單個核細胞(mononuclear cells，MNC)懸液，經(jīng)破膜后置于75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1 h 40 min，留取貼壁細胞；加入完全培養(yǎng)液(含10 ng/mL rrGM-CSF和10 ng/mL rrIL-4)于37℃、5%(體積分數(shù))CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)10 d，收集懸浮的細胞進行計數(shù)，按1×106/mL水平種于培養(yǎng)板中(完全培養(yǎng)基中的FCS為經(jīng)超高速離心去除外泌體成份的血清)，分別加入阿托伐他汀溶液(終濃度10 μmol/L)和等體積的DMSO，記為他汀BMDCs和對照BMDCs。培養(yǎng)48 h后通過熒光顯微鏡觀察不同組BMDCs的形態(tài)學變化，再分別收集細胞培養(yǎng)上清和相應組的BMDCs。分別取他汀BMDCs和對照BMDCs洗滌后，加入PE標記的抗大鼠CD80抗體(BioLegend，San Diego，CA，USA)，F(xiàn)ITC標記的抗大鼠CD86(BioLegend)和FITC標記的抗大鼠主要組織相容性復合體Ⅱ(MHC-Ⅱ)抗體(eBioscience，San Diego，CA，USA)，4 ℃下孵育30 min，洗滌后經(jīng)流式細胞儀檢測CD80+、CD86+和MHC-Ⅱ+細胞的百分比。

1.3.3 外泌體的提取及鑒定：將不同組的BMDCs培養(yǎng)上清進行梯度離心(n=30)，分別以300g(5 min)、1200g(20 min)和10 000g(30 min)離心以去除細胞和碎片；隨后按100 000g離心1 h，離心2遍；最后將提取的外泌體懸于PBS中，并通過K5600 MicroSpectroPhotoMeter(北京凱奧技術(shù)發(fā)展有限公司，中國)進行定量分析。按文獻[4]實驗方法，采用電鏡觀察外泌體形態(tài)，表現(xiàn)為一種直徑約30～100 nm的微囊泡結(jié)構(gòu)；采用流式細胞術(shù)檢測外泌體表面共刺激分子的表達情況，發(fā)現(xiàn)他汀Dex和對照Dex均可表達相應BMDCs來源的共刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ。

1.3.4 動物分組：利用隨機數(shù)字表將10只EAMG大鼠隨機分為他汀Dex治療組和對照Dex治療組，每組5只。于免疫后的第5天和第13天分別給予尾靜脈注射相應的外泌體(每只大鼠每次注射10 μg)，觀察大鼠癥狀直至發(fā)病高峰期(免疫后第42天)。

1.3.5 淋巴結(jié)MNC懸液的制備：在發(fā)病的高峰期，無菌條件下取腹股溝淋巴結(jié)，在放有無菌濾網(wǎng)的培養(yǎng)皿中研磨淋巴結(jié)，制備MNC懸液，計數(shù)后調(diào)整細胞水平為2×106個細胞/mL。

1.3.6 流式細胞術(shù)檢測：取1×106個淋巴結(jié)MNC，加入PE標記的抗大鼠CD3抗體、FITC標記的抗大鼠CD161a抗體、FITC標記的抗大鼠IFN-γ抗體(Biolegend)、PE標記的抗大鼠IL-10抗體(Pharmingen，San Diego，CA，USA)，4℃避光孵育30 min，洗滌后通過流式細胞儀檢測各組EAMG大鼠淋巴結(jié)MNC中NK細胞、NK T細胞及IFN-γ+、IL-10+細胞的表達情況，結(jié)果以占淋巴結(jié)MNC的百分比表示。

1.3.7 血清抗R97-116 IgG抗體及其亞型檢測：采用ELISA法進行檢查。首次免疫后第42天分別處死2組EAMG大鼠，留取心臟血血清。用R97-116(5 μg/mL)包被平底的96孔酶標板，4℃保濕過夜。用含有0.05%(質(zhì)量濃度)Tween 20和10%(體積分數(shù))FCS的PBS 200 μL封閉酶標板，37℃孵育1.5 h。將待測血清標本(1∶100稀釋)加至孔中，每例標本設置3復孔，孵育2 h。后加入生物素標記的兔抗大鼠IgG(1∶3000；北京博奧森生物有限公司，中國)、IgG1、IgG2a和IgG2b(1∶500；BioLegend)孵育1 h。加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，孵育30 min。洗板后加入四甲基聯(lián)苯胺底物顯色。用酶標儀測定450 nm處吸光度〔D(λ)〕值。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1BMDCs及其源性外泌體的特征BMDCs經(jīng)與阿托伐他汀和DMSO共培養(yǎng)48 h后的形態(tài)學如圖1所示，與DMSO相比，阿托伐他汀與BMDCs共培養(yǎng)后能夠明顯抑制EAMG大鼠BMDCs的樹突生長，進而影響B(tài)MDCs的正常形態(tài)。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照BMDCs組比較，他汀BMDCs組表面表達共刺激分子CD80和CD86明顯降低(CD80：t=28.1，P<0.01；CD86：t=9.6，P<0.01)，而MHC-Ⅱ分子表達無統(tǒng)計學差異(t=-0.96，P=0.41)(圖2)。

注：MHC-Ⅱ：主要組織相容性復合體Ⅱ；aP<0.01 圖2 流式細胞術(shù)檢測兩組BMDCs表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子表達(n=10)

2.2EAMG大鼠臨床癥狀比較與對照Dex治療組比較，他汀Dex治療組EAMG大鼠臨床癥狀明顯緩解(P<0.05)。結(jié)果見圖3。

注：EAMG：實驗性自身免疫性重癥肌無力，表1、圖4同；aP<0.05 圖3 EAMG大鼠免疫后不同時間臨床評分比較(n=5)

2.3流式細胞術(shù)檢測他汀Dex能夠上調(diào)EAMG大鼠淋巴結(jié)MNC中NK細胞(CD3-CD161a+)數(shù)量(P<0.05)，但對NK T細胞(CD3+CD161a+)數(shù)量卻無統(tǒng)計學影響(P>0.05)。他汀Dex治療組IFN-γ+細胞數(shù)較對照Dex治療組降低(P<0.05)，而IL-10+細胞數(shù)在兩組之間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結(jié)果見表1。

2.4各組EAMG大鼠血清抗R97-116IgG抗體及其亞型水平他汀Dex治療組血清抗R97-116 IgG抗體及其亞型IgG2a、IgG2b抗體水平明顯低于對照Dex組(IgG：t=3.75，IgG2a：t=2.33，IgG2b：t=2.92；均P<0.05)，而對其亞型IgG1抗體水平無統(tǒng)計學影響(t=-0.31，P=0.76)(圖4)。

注：aP<0.05 圖4 兩組EAMG大鼠血清抗R97-116 IgG抗體及其亞型抗體水平比較(n=5)

3 討論

DCs作為一種免疫調(diào)節(jié)細胞，可誘導免疫反應或免疫耐受，但也具有一定的局限性，如不易保存等。DCs源性外泌體可攜帶MHC-Ⅰ/Ⅱ、CD80、CD86、CD40(與抗原提呈和T細胞刺激作用相關(guān))等與DCs相似的分子。外泌體可通過這些分子與相應的受體細胞相互作用，進而產(chǎn)生一系列的免疫應答反應。研究表明，未成熟BMDCs源性外泌體攜帶較低水平的MHC-Ⅱ分子及共刺激分子，能夠延長腸移植大鼠的存活率[5]。未成熟DCs源性外泌體因低表達MHC-Ⅱ、CD86和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)，能夠明顯減少抗原特異性T細胞的活化[6]。經(jīng)基因修飾的BMDCs來源的外泌體可改善膠原蛋白誘導的關(guān)節(jié)炎，這種作用主要是由于其表面低表達的MHC-Ⅱ和高表達的FasL分子分別影響抗原提呈和細胞凋亡所致[7]。

表1 流式細胞術(shù)檢測兩組EAMG大鼠淋巴結(jié)MNC中NK細胞、NK T細胞及IFN-γ+、IL-10+細胞的表達(±s，%)

注：MNC：單個核細胞；NK：自然殺傷細胞；IFN-γ：γ干擾素；IL-10：白細胞介素10

作者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物誘導的BMDCs分泌的外泌體(他汀Dex)可通過IDO/Treg途徑及部分依賴于FasL/Fas途徑來誘導EAMG大鼠的免疫耐受[4]。

他汀類藥物是一種3-羥基-3甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的抑制劑，不僅可抑制膽固醇的合成，而且具有免疫調(diào)節(jié)的作用[8]。他汀類藥物可抑制人類DCs表面成熟相關(guān)性分子如CD83、CD40、CD86和人類白細胞相關(guān)抗原-DR的表達，降低其誘導T細胞增殖的能力[9-10]；還能夠以劑量依賴性的方式抑制小鼠BMDCs表面共刺激分子MHC-Ⅱ和CD40的表達[11]。作者研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀在體外能夠抑制BMDCs的成熟，影響其形態(tài)學及降低表面共刺激分子CD80、CD86的表達；經(jīng)體外培養(yǎng)的BMDCs分泌的外泌體成份，在電鏡下表現(xiàn)為直徑約30～100 nm的微小囊泡，經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定，顯示其可表達與來源BMDCs相似的CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子[4]。以上結(jié)果提示可成功提取BMDCs源性外泌體。經(jīng)他汀類藥物誘導后的BMDCs所分泌的外泌體則具有耐受性BMDCs的特征，即表現(xiàn)為耐受性外泌體(他汀Dex)，同樣可誘導EAMG大鼠的免疫耐受，但其對EAMG大鼠體內(nèi)NK細胞及NK T細胞的影響尚未見報道。

NK細胞是一種異質(zhì)性多功能的免疫細胞，參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程[12-13]。有報道顯示，NK細胞可產(chǎn)生IFN-γ和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎性因子，這些炎性因子可上調(diào)抗原提呈細胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表達；另一方面，IFN-γ誘導的單核細胞因子，可招募NK細胞并活化T細胞[14-15]。NK T細胞是一類新的免疫調(diào)節(jié)細胞，可通過分泌IL-4、IL-10和IFN-γ、TNF-α調(diào)節(jié)Th型細胞的分化，并且通過激活細胞毒效應細胞在天然免疫和后天免疫中發(fā)揮重要作用[16]。NK及NK T細胞在自身免疫性疾病，尤其是MG和EAMG中的作用機制還存在一定爭議。研究發(fā)現(xiàn)，清除實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)中的NK 細胞，可導致中樞神經(jīng)脫髓鞘病變加重，表明NK細胞在EAE中起保護作用[17]。而在EAMG小鼠模型中，NK1.1+細胞能夠特異性導致抗AChR IgG2b含量增加，從而促進EAMG的進展[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在爆發(fā)型MG患者中，其NK細胞的功能降低[19]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)他汀Dex治療的EAMG大鼠臨床癥狀較輕，血清抗R97-116 IgG抗體水平較低，這與NK細胞上調(diào)有關(guān)，表明NK細胞在EAMG中起保護作用。本研究結(jié)果還顯示，他汀Dex治療后能夠下調(diào)IFN-γ+細胞數(shù)，而IL-10+細胞數(shù)卻無統(tǒng)計學變化，提示他汀Dex可通過除NK及NK T細胞以外的途徑發(fā)揮作用。本文研究與部分既往研究結(jié)果不一致，可能與動物模型不同有關(guān)，其具體的作用機制還有待于深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，阿托伐他汀在體外能夠成功誘導耐受性BMDCs的產(chǎn)生，這些耐受性BMDCs能夠分泌他汀Dex，將這些他汀Dex注射于EAMG大鼠體內(nèi)后，能夠明顯緩解EAMG的病情。重要的是，這些他汀Dex在體內(nèi)可通過上調(diào)NK細胞數(shù)量進而發(fā)揮其誘導EAMG免疫耐受的作用。