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(1.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，浙江 紹興 312000；2.浙江工業(yè)大學，浙江 杭州 310014)

黃酒是以谷物為原料，由霉菌、酵母和細菌等多種微生物及酶共同參與下邊糖化邊發(fā)酵釀制而成的.黃酒發(fā)酵的特點是開放式發(fā)酵、雙邊發(fā)酵、高濃釀造和低溫長時間后發(fā)酵.當營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，細胞進入靜止期，生長停滯[1]，生成高濃度酒精.釀造好黃酒，要利用好有益微生物，抑制有害微生物，做到節(jié)能減排，合理利用能源，提高黃酒生產(chǎn)利潤.

對黃酒原料流失進行分析，發(fā)現(xiàn)部分在浸米這一步驟中從米漿水中流失，部分在生產(chǎn)過程中變成廢水、廢氣和廢糟流失.調(diào)查企業(yè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，大米黃酒的出酒糟率為20%左右，糯米黃酒的出酒糟率為35%～40%.以目前的技術(shù)水平，可以利用淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶和纖維素酶等酶制劑的反應(yīng)機理改善黃酒工藝，提高原料利用率，降低出酒糟率[2-3].米漿水中含有豐富的氨基酸和其他有機物質(zhì)，能提高黃酒中的氨基酸態(tài)氮、酯類物質(zhì)與酒精體積分數(shù)[4]，因此，將米漿水循環(huán)利用或者將米漿水作為部分投料水，不但能減少黃酒企業(yè)廢水、廢渣的排污費用，而且能使黃酒的出酒率有一定的增加.通過研究發(fā)酵機理改變黃酒生產(chǎn)工藝配方，讓黃酒原料盡可能的高度發(fā)酵，從而提高出酒率，降低出糟率，減少排廢費用，降低生產(chǎn)成本.從整個黃酒的生產(chǎn)工藝中研究原料的高度發(fā)酵，有利于黃酒行業(yè)的清潔生產(chǎn)與循環(huán)經(jīng)濟.通過不同配方的發(fā)酵試驗，經(jīng)過理化檢測與感官品評的方法來取得最優(yōu)配方.

1 材料與方法

1.1 材 料

酸性蛋白酶50 000 U/g，淀粉酶2 000 U/g，糖化酶50 000 U/g，纖維素酶20 000 U/g,張家港市金源生物化工有限公司；大米：市售；釀造用水：紹興地區(qū)自來水；米漿水：大米浸米產(chǎn)生；生麥曲：學生自己生產(chǎn)；安琪酵母(黃酒高活性干酵母)：安琪酵母股份有限公司.

1.2 主要儀器

恒溫水浴鍋，生化培養(yǎng)箱BSP-150，上海博迅儀器廠；pH-3C酸度計，上海精密科學上海雷磁儀器廠；722型分光光度計，上?？茣钥茖W儀器有限公司；FA2004電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；酒精蒸餾裝置一套.

1.3 工 藝

1.3.1 工藝流程圖

黃酒釀造工藝流程圖如圖1.

圖1 黃酒釀造工藝流程圖Fig.1 Yellow wine brewing process flow chart

1.3.2 黃酒釀造操作要點

浸米：按機械化生產(chǎn)實際操作的溫度進行浸米試驗，浸米時間為48 h，浸米室溫15 ℃，水溫25 ℃，在25 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)保溫浸米.

稱取大米6 kg于小桶中，加水到浸沒米10 cm，浸好后分裝成6小份，蒸飯.擴大試驗：室溫下浸米，浸到米用手輕捻一下即能粉碎為止.浸米的目的主要是為了讓大米吸水膨脹，容易蒸透.

蒸飯：小試蒸飯，把浸漬過的米用紗布包好，用鍋蒸，擴大試驗用蒸汽桶蒸，米飯要求顆粒分明，疏松不糊，內(nèi)無白心生粒，成熟度均勻一致.

1.3.3 投料方案

在黃酒生產(chǎn)中，為了降低生產(chǎn)成本而少用麥曲，往往會導致酶濃度偏低，反應(yīng)速度降低，為使發(fā)酵正常進行，采用添加外援酶制劑的方法來提高酶的濃度.以目前企業(yè)生產(chǎn)的配方5作為對照，為減少麥曲用量，按1 g麥曲具有的糖化率、液化率和酸性蛋白酶活力分別是800～1 000,16,26 mg/(g·h)為依據(jù)，結(jié)合各種酶的性能計算不同酶制劑添加量.得出試驗配方的質(zhì)量比為

配方1m(大米)∶m(水)∶m(淀粉酶)∶m(酸性蛋白酶)∶m(糖化酶)∶m(纖維素酶)∶m(活性干酵母)=1∶1∶0.000 5∶0.000 8∶0.003∶0.000 05∶0.001.

配方2m(大米)∶m(水)∶m(米漿水)∶m(淀粉酶)∶m(酸性蛋白酶)∶m(糖化酶)∶m(纖維素酶)∶m(活性干酵母)=1∶0.7∶0.3∶0.000 5∶0.000 8∶0.003∶0.000 05∶0.001.

配方3m(大米)∶m(水)∶m(生麥曲)∶m(酸性蛋白酶)∶m(纖維素酶)∶m(活性干酵母)=1∶1∶0.15∶0.000 28∶ 0.000 2∶0.001.

配方4m(大米)∶m(水)∶m(米漿水)∶m(生麥曲)∶m(酸性蛋白酶)∶m(纖維素酶)∶m(活性干酵母)=1∶0.7∶0.3∶0.15∶0.000 28∶0.000 2∶0.001.

配方5m(大米)∶m(水)∶m(生麥曲)∶m(活性干酵母)=1∶1∶0.20∶0.001.

配方6m(大米)∶m(水)∶m(米漿水)∶m(生麥曲)∶m(活性干酵母)=1∶0.7∶0.3∶0.20∶0.001.

所有的酶都是沒有經(jīng)過任何處理直接添加.

活性干酵母活化方法：用量為活性干酵母質(zhì)量25倍的含糖量為2%糖水中加入活性干酵母，經(jīng)35～38 ℃活化15～30 min，產(chǎn)生氣泡1～2 min即可使用.

1.3.4 過程工藝

投料時，將浸米2 d的米漿水煮沸后冷卻[5]，用米漿水替代30%投料水投料[6]，以減少清水用量，并保持總用水量不變.投料時醪液溫度控制在26～27 ℃.發(fā)酵時頭耙最高溫度為30 ℃[7]，4 h后開耙，5 d后降溫到15 ℃左右進入后發(fā)酵期.發(fā)酵時間設(shè)為20 d.

1.3.5 糖度的測定方法

見參考文獻[8].

1.3.6 酒精體積分數(shù)測定方法

見參考文獻[8].

1.3.7 酸度與氨基酸態(tài)氮的測定方法

見參考文獻[8].

2 結(jié)果與討論

黃酒是享用性飲料，不但理化指標要符合要求，感官指標也不能忽視.因此優(yōu)質(zhì)的黃酒理化與感官兩者都應(yīng)兼顧.

2.1 不同配方發(fā)酵20 d的發(fā)酵醪的感官品質(zhì)

20 d的發(fā)酵醪在國家級黃酒評委的品嘗下得出如下結(jié)論，結(jié)果見表1.

表1 不同配方發(fā)酵20 d的感官品質(zhì)Table 1 Sensory quality of different formulations during 20-day

由表1可知：20 d的發(fā)酵醪液，配方1與2的口味相對單薄，醇香不明顯.配方3，4，5，6口味醇厚，醇香濃郁，但麥曲配比高的配方5、配方6苦澀味重.可以看出黃酒中的苦澀味主要來源是麥曲.加入米漿水的配方2，4，6與不加米漿水的配方1，3，5相比口味相對粗糙.按黃酒國標GB/T 13662—2008的感官要求來判定.對于半干型黃酒的感官標準來定性，要突出醇厚、鮮爽，6個配方從優(yōu)到劣的順序是：配方3>配方4>配方5>配方6>配方1>配方2.

2.2 不同配方不同發(fā)酵天數(shù)理化指標結(jié)果分析

對不同配方發(fā)酵7，15，20 d的酒精變化圖、糖度變化圖、酸度變化圖和氨基酸態(tài)氮的變化圖進行分析討論.

從圖2分析可知，添加30%米漿水的2，4，6配方與未添加米漿水的1，3，5配方相比，添加米漿水的配方產(chǎn)生的酒精體積分數(shù)都稍微比未添加米漿水的高，這說明米漿水內(nèi)含有一定量的淀粉等物質(zhì)，在發(fā)酵時可以被酵母利用.反應(yīng)機理是淀粉在淀粉酶作用將淀粉轉(zhuǎn)化為糊精和可發(fā)酵性糖，可發(fā)酵性糖在酵母菌厭氧發(fā)酵條件下產(chǎn)生酒精.化學反應(yīng)式為

圖2 不同配方發(fā)酵過程中酒精體積分數(shù)的變化Fig.2 Changes of alcohol content in fermentation process of different formulas

從圖2可知，單純酶制劑的配方1，2與配方3，4，5，6相比，7 d生成的酒精含量高，15，20 d的酒精含量升高但幅度不大，說明酶制劑能縮短發(fā)酵時間.有麥曲的配方，起初發(fā)酵慢些，后期具有持久性.加入酸性蛋白酶與纖維素酶配方3，4與不加酸性蛋白酶與纖維素酶的配方5，6相比，配方3，4的酒精體積分數(shù)高于配方5，6，這說明適量的酸性蛋白酶與纖維素酶能提高發(fā)酵醪的酒精體積分數(shù).配方4比配方6出酒率高2%左右.僅從發(fā)酵醪的酒精體積分數(shù)考慮，前3個配方從優(yōu)到劣的順序是：配方4>配方6>配方3.

黃酒中甜味物質(zhì)主要來自原料中的淀粉經(jīng)糖化發(fā)酵及酵母酒精發(fā)酵后殘留下來的糖分，主要是葡萄糖、麥芽糖、異麥芽糖panose糖、異麥芽丙糖、Telore、低聚糖和戊糖等，其中葡萄糖占總糖量的50%～70%.在糖化過程中，部分葡萄糖苷在霉菌分泌的葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶作用下，重新結(jié)合形成難發(fā)酵或不發(fā)酵的異麥芽糖、麥芽三糖和潘糖等低聚糖.這些糖類是黃酒甘甜味的重要來源，也協(xié)調(diào)了黃酒的酒體.

從圖3可知:不加麥曲時，配方1與2相比較，添加米漿水能促進糖化，配方2的糖度一直高于配方1.原因可能是加入米漿水后增加了醪液的酸度，降低了醪液pH，有利于提高糖化酶和淀粉酶的活性，尤其是糖化酶的活性，因為大部分酶的活力受環(huán)境pH的影響，在一定的pH下反應(yīng).酶活力最大時的pH通常稱為酶的最適pH.黃酒用糖化酶最適pH為4.6.由于配方1與2沒有加入麥曲，就沒有霉菌分泌的葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶，酶系較單一，使酒體顯得淡薄.這與20 d的感官品質(zhì)分析一致.

圖3 不同配方發(fā)酵過程中糖質(zhì)量濃度的變化Fig.3 Changes of sugar in fermentation process of different formula

加麥曲、不加米漿水時，配方3與配方5相比，配方3能縮短糖度下降的時間，從這一現(xiàn)象中可知纖維素酶與酸性蛋白酶能縮短發(fā)酵時間.

有麥曲存在的條件下，配方5與6相比，配方6的20 d的糖度總體低些；配方3與配方4相比，配方4的20 d的糖度總體也低一些.這也說明米漿水中的游離氨基酸及短肽都可通過細胞膜直接吸收，這種吸收行為必然促進酵母菌和霉菌生長[9]，使酵母菌最終利用糖度的能力強，發(fā)酵能力強，原料利用率高，與圖2酒精變化圖相對應(yīng).前3個配方優(yōu)到劣的順序是：配方4>配方6>配方3.

黃酒醪中的有機酸很多，產(chǎn)生的途徑也很多.主要來自黃酒釀造過程中微生物代謝，其次來自原料、麥曲和漿水.大多數(shù)有機酸是由細菌生成的，酵母菌在產(chǎn)酒精時，會產(chǎn)生很多有機酸，酒曲中的根霉等霉菌也產(chǎn)生有機酸.黃酒中大部分乳酸由乳酸桿菌產(chǎn)生，其次是麥曲中的根霉和毛霉.乙酸主要是醋桿菌屬和葡萄糖桿菌屬在黃酒釀造過程中代謝產(chǎn)生.它們產(chǎn)生的主要途徑為

1) 異型乳酸發(fā)酵，經(jīng)HMP途徑，其產(chǎn)物因菌種而異，除生成乳酸外，還同時生成乙酸、酒精、甘露醇等成分.

2) 同型乳酸發(fā)酵經(jīng)EMP途徑，生成為乳酸，即

3) 酵母菌厭氧發(fā)酵，把2分子葡萄糖轉(zhuǎn)變成酒精、乙酸、甘油與二氧化碳，即

4) 乙酸菌將酒精氧化為乙酸與水，即

5) 糖經(jīng)發(fā)酵生成乙醛，再經(jīng)歧化作用生成乙酸與酒精.

從圖4可知：單純使用酶制劑的配方1與2相比，7 d的醪液配方2比配方1的酸度低，這有可能是配方2中加入米漿水對部分酶制劑與生酸菌有一定的抑制作用，起初起到以酸制酸的作用，后來隨著發(fā)酵的進行，對發(fā)酵環(huán)境慢慢適應(yīng)，使酸度慢慢上升，最后兩者逐漸接近.

圖4 不同配方發(fā)酵過程酸質(zhì)量濃度的變化Fig.4 The change of acidity in fermentation process of different formulas

配方3，5相比可知，配方3發(fā)酵7 d的酸度明顯高于配方5，但到20 d時兩者的酸度相對接近了，這說明加入纖維素酶與酸性蛋白酶的配方3，初始發(fā)酵時，氨基酸態(tài)氮含量豐富，使發(fā)酵醪液氮源多，這不但利于酵母菌的生長，也有利于其他生酸菌的生長.所以7 d天的酸度，配方3明顯高于配方5.從圖中也可看出，只要控制好發(fā)酵的溫度，后期會縮小差距.如果發(fā)酵溫度控制不好，就容易使配方3的醪液酸敗.配方4與配方3相比，發(fā)酵7 d的酸度更高，這主要是加了米漿水使醪液本身的原始酸度增高的緣故，但到了后期兩者酸度慢慢接近.從6個配方酸度的發(fā)酵規(guī)律中可知，配方1與2使用單純酶制劑發(fā)酵的酸度相對低些，加麥曲與加部分酶制劑的酸度相對高一些，但是也沒有超過黃酒國標規(guī)定.這表明在正常發(fā)酵的情況下，僅從酸度單方面考慮這些配方都是可行的.

黃酒中氨基酸含量十分豐富，是飲料酒中氨基酸含量最高的酒種，氨基酸的來源有三方面：一是黃酒原料中的大米與小麥中的蛋白質(zhì)在麥曲的制作過程中受酶的作用部分分解成氨基酸；二是來自酵母和霉菌等微生物的自溶(也是蛋白質(zhì)分解);三是黃酒糖化過程中也產(chǎn)生氨基酸.蛋白質(zhì)在酶的作用下，可水解成各種氨基酸.黃酒中的氨基酸分中性氨基酸、堿性氨基酸和酸性氨基酸，其中大部份是中性氨基酸.精氨酸、賴氨酸、組氨酸是堿性氨基酸.酸性氨基酸是谷氨酸和天冬氨基酸.氨基酸是黃酒酵母生長和繁殖所必需的營養(yǎng)氮源.

從圖5中可知：米漿水的添加量對總糖和氨基酸態(tài)氮的影響有點大，尤其是對氨基酸含量的提高有很大幫助.這主要是由于米漿水中氨基酸的含量較高，因為添加米漿水后，發(fā)酵醪的發(fā)酵起始氨基酸含量高，這有利于酵母菌、霉菌等微生物的生長繁殖，原料利用率高，最終促進了15，20 d發(fā)酵醪中的酒精體積分數(shù)含量也相應(yīng)提升[10].從配方3與配方5相比可知，加入纖維素酶與酸性蛋白酶的確能提高發(fā)酵醪中的氨基酸態(tài)氮的含量0.08左右.從氨基酸態(tài)氮的指標是看出配方3與配方4是相對合適的配方.

圖5 不同配方發(fā)酵過程氨基酸態(tài)氮的變化 Fig.5 FAN in fermentation process of different formula

3 結(jié) 論

黃酒發(fā)酵是開放式雙邊發(fā)酵——邊糖化邊發(fā)酵.從實驗研究中可知，綜合6個配方的感官品質(zhì)與理化指標分析，不加麥曲僅使用單純的酶制劑生產(chǎn)的黃酒酒精體積分數(shù)相對低些，低于18%，原料的利用率不高，酒體也相對淡薄，需要進一步探究各種酶的活性來提升品質(zhì)[11]，因此排除配方1與2.如果不考慮米漿水中的有害成份，配方4是最合適的，如果考慮米漿水中的有害成份，配方3是合理的，即m(大米)∶m(水)∶m(生麥曲)∶m(酸性蛋白酶)∶m(纖維素酶)∶m(活性干酵母)=1∶1∶0.15∶0.000 28∶0.000 2∶0.001.不考慮米漿水中的有害成分，理論上配方4最合適.多次試驗表明，只要控制發(fā)酵溫度在30 ℃左右，發(fā)酵都會正常進行，沒有酸敗的風險.用活性干酵母代替企業(yè)自己生產(chǎn)的酒母可以節(jié)約成本，加入酸性蛋白酶與纖維素酶能提高4%左右的出酒率，因此，從企業(yè)角度講，回用黃酒米漿水能做到節(jié)能減排.米漿水的利用可以減少投料用水30%，節(jié)約水資源，減少排污費與自來水費，提高出酒率，降低出糟率.從小的層面上為企業(yè)增加效益，從大層面上，減少廢物排放符合國家節(jié)能減排、綠色環(huán)保的主題.