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(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

微生物醛酮還原酶(Aldo-keto reductase, AKR)是醛酮還原酶家族的主要組成，通常為NADP(H)專一性依賴型，含有高度保守的(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)[1].微生物醛酮還原酶具有來(lái)源的豐富性和催化底物的多樣性等特性，其作為生物催化劑在酶法合成手性醇方面已有成功的應(yīng)用.例如，王亞軍等[2]通過(guò)理性設(shè)計(jì)對(duì)源自Kluyveromyceslactis的醛酮還原酶進(jìn)行了分子改造，該突變酶與源自Exiguobacteriumsibiricum的葡萄糖脫氫酶進(jìn)行共表達(dá)構(gòu)建整細(xì)胞催化劑，并應(yīng)用于制備光學(xué)純6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯，生產(chǎn)效率達(dá)到了243.2 kg/(m3·d).

D-泛解酸內(nèi)酯作為一種典型的手性醇化合物，是用于D-泛酸及D-泛醇合成的重要手性中間體[3].目前，在工業(yè)規(guī)模上通過(guò)內(nèi)酯水解酶催化混旋泛解酸內(nèi)酯的選擇性拆分來(lái)制備D-泛解酸內(nèi)酯，而基于酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶和泛解酸內(nèi)酯脫氫酶的氧化還原酶法在酶法合成D-泛解酸內(nèi)酯方面已展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力[4].本課題組前期研究已從釀酒酵母中克隆表達(dá)了2 個(gè)酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶SceCPR1[5]和SceAKR3C1[6]，其中SceAKR3C1屬于醛酮還原酶家族.本研究從裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)基因組克隆表達(dá)了一個(gè)具有酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶活力的醛酮還原酶.在此基礎(chǔ)上，對(duì)該重組酶的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了其最適誘導(dǎo)溫度、轉(zhuǎn)速、時(shí)間、接種量以及最適誘導(dǎo)劑濃度等，為該酶在不對(duì)稱還原酮基泛解酸內(nèi)酯上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與載體

裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)菌種由本實(shí)驗(yàn)室保藏，表達(dá)宿主菌EscherichiacoliBL21(DE3)、E.coliTrans-T1克隆宿主菌和載體pEASY-Blunt E1購(gòu)自北京全式金(TransGen Biotech)生物技術(shù)有限公司.

1.1.2 試 劑

FastPfuFly DNA Polymerase及配套材料購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；用于質(zhì)粒提取和DNA片段純化的試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程(TaKaRa)有限公司；酵母基因組提取試劑盒、輔酶NADPH、蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液BSA和異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)等購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.1.3 引 物

利用BLAST軟件根據(jù)S.pombe基因組中吲哚-3-乙醛還原酶基因(GenBank: NM_001019853.2)進(jìn)行同源分析，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增醛酮還原酶基因引物如下：上游引物SpoAKR3C2 F為5′-ATGCTTATCGCTGCTATG-3′，下游引物SpoAKR3C2 R為5′-CTCATCCATGTGCTTCAT-3′.引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成.

1.1.4 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L.固體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的瓊脂粉.培養(yǎng)基于0.1 MPa，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min.

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，調(diào)節(jié)pH至7.0.固體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的瓊脂粉.培養(yǎng)基于0.1 MPa，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min.

LB/Amp培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基加入氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL.

LB/Kan培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基加入卡那霉素(Kanamycin, Kan)至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL.

1.2 方 法

1.2.1 醛酮還原酶SpoAKR3C2的基因克隆

以S.pombe基因組為DNA模版，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以獲得目的片段，PCR擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性20 s，55 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸20 s，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為35，72 ℃復(fù)延伸5 min.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并利用DNA片段純化試劑盒進(jìn)行回收.純化后PCR產(chǎn)物與載體pEASY-Blunt E1連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50 μLE.coliTrans-T1感受態(tài)細(xì)胞中.采用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆子，送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序以進(jìn)一步檢測(cè).將測(cè)序所得的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的基因序列進(jìn)行比對(duì)、分析，含有目的片段的質(zhì)粒命名為pEASY-Blunt E1-SpoAKR3C2.

1.2.2 密碼子優(yōu)化與重組菌的構(gòu)建

目的基因通過(guò)密碼子優(yōu)化軟件(http://www.jcat.de/)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，由上海捷瑞生物工程有限公司合成密碼子優(yōu)化后的目的基因，并插入在pET28b表達(dá)載體上，插入位點(diǎn)為NdeI與BamH I，所得的質(zhì)粒命名為pET28b-SpoAKR3C2.重組質(zhì)粒pET28b-SpoAKR3C2轉(zhuǎn)入50 μL剛解凍的感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中，孵育1 h后將其涂布于LB/Kan固體平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置過(guò)夜培養(yǎng).挑取陽(yáng)性克隆子，接種于含Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃和200 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)10 h，作為種子液，即重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-SpoAKR3C2.按2%接種量擴(kuò)大培養(yǎng)至Kan抗性的150 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃和200 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)至菌體濃度OD600為0.6～0.8時(shí)，添加誘導(dǎo)劑0.1 mol/L IPTG.然后在22 ℃，150 r/min條件下誘導(dǎo)10 h.誘導(dǎo)完成后，所得培養(yǎng)物利用12% SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)分析.

1.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將新鮮的種子液接種至含有相性抗生素(Kan)的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng).以未接種的LB液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照進(jìn)行零點(diǎn)校正及零時(shí)測(cè)定，間隔一定的時(shí)間取樣，選用600 nm波長(zhǎng)進(jìn)行光電比濁測(cè)定其光密度值.

1.2.4 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

以1.2.2中所述的誘導(dǎo)流程為標(biāo)準(zhǔn)的誘導(dǎo)流程，分別考察種子液接種量、誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、轉(zhuǎn)速以及誘導(dǎo)劑濃度等對(duì)產(chǎn)醛酮還原酶SpoAKR3C2的影響.其中，誘導(dǎo)溫度為16，19，22，25，28，31，34 ℃；誘導(dǎo)時(shí)間為6，8，10，12，14，16 h；誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為120，130，140，150，160，170 r/min；誘導(dǎo)劑終濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3 mmol/L；種子液接種量(體積分?jǐn)?shù))為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%.

1.2.5 粗酶液制備及酶活力測(cè)定

誘導(dǎo)完成后，4 ℃條件下6 000 r/min離心15 min收集菌體沉淀，并用超純水反復(fù)重懸清洗，再離心收集菌體.在50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)重懸菌體至終質(zhì)量濃度為50 g/L，充分混懸后吸取菌懸液10 mL，然后在冰浴條件下超聲波破碎細(xì)胞.超聲破碎參數(shù)：工作時(shí)間1 s，間歇時(shí)間1 s，總工作時(shí)間為3 min.細(xì)胞裂解液4 ℃，6 000 r/min離心15 min，收集上清即為含醛酮還原酶SpoAKR3C2粗酶液.

實(shí)驗(yàn)選取酮基泛解酸內(nèi)酯為底物，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定酶活力，結(jié)合菌體濃度確定最佳誘導(dǎo)條件.標(biāo)準(zhǔn)酶活測(cè)定體積為2.5 mL，包括：10 mmol/L酮基泛解酸內(nèi)酯、10 μL醛酮還原酶SpoAKR3C2細(xì)胞破碎上清液和0.1 mmol/L NADPH，用0.2 mol/L PBS緩沖液(pH 6.0)補(bǔ)至2.5 mL，反應(yīng)溫度35 ℃.上述反應(yīng)通過(guò)最后加入NADPH和底物啟動(dòng)反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)1 min內(nèi)NADPH在340 nm波長(zhǎng)下的降低來(lái)確定酶活.NADPH的摩爾消光系數(shù)為6.22×103L/(mol·cm)，酶活力單位(U)定義為每分鐘內(nèi)消耗1 μmol NADPH所需的酶量.

2 結(jié)果與討論

2.1 醛酮還原酶SpoAKR3C2的克隆表達(dá)

以S.pombe基因組為DNA模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得目的基因，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)以及測(cè)序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其大小為852 bp，與目的序列大小相符.通過(guò)軟件BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與S.pombe中吲哚-3-乙醛還原酶基因(GenBank: NM_001019853.2)序列一致.目的基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后構(gòu)建獲得重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-SpoAKR3C2.誘導(dǎo)表達(dá)的SpoAKR3C2在SDS-PAGE上對(duì)應(yīng)于大小約為36 kD的條帶(圖2)，相比于未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照，誘導(dǎo)后菌體在大小約36 kD處出現(xiàn)明顯的加粗條帶，與預(yù)期相符.誘導(dǎo)所得的粗酶液經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)酶活力檢測(cè)，其比活力約為2 U/mg.進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行催化反應(yīng)驗(yàn)證，在2 mL反應(yīng)體系中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的凍干菌粉為生物催化劑，以100 mmol/L酮基泛解酸內(nèi)酯為底物，偶聯(lián)葡萄糖脫氫酶催化100 mmol/L葡萄糖脫氫提供輔酶循環(huán)，以0.3 mmol/L NADP+為輔酶，在pH 6.0，45 ℃和200 r/min下反應(yīng)7 h，D-泛解酸內(nèi)酯得率約為80%，光學(xué)純度高達(dá)99%以上.鑒于該酶的工業(yè)應(yīng)用前景，筆者針對(duì)目的菌株E.coliBL21 (DE3)/pET 28b-SpoAKR3C2進(jìn)行了誘導(dǎo)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn).

M—DL5000 DNA Marker；1—PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證膠圖Fig.1 The agarose gel electrophoresis of PCR amplification product

M—Protein Marker；1—未誘導(dǎo)菌液；2—40 mmol/L咪唑洗脫液洗脫的酶液；3—100 mmol/L咪唑洗脫液洗脫的酶液；4—250 mmol/L咪唑洗脫液洗脫的酶液；5—誘導(dǎo)后菌液圖2 醛酮還原酶SpoAKR3C2 SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of an aldo-keto reductase SpoAKR3C2

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以不同時(shí)間細(xì)菌培養(yǎng)液的OD600值為縱坐標(biāo)，繪制重組菌E.coliBL21 (DE3)/pET28b-SpoAKR3C2菌體濃度隨時(shí)間的變化曲線(圖3).研究發(fā)現(xiàn)：重組菌在0～1.5 h內(nèi)生長(zhǎng)緩慢；1.5 h后，菌體濃度直線上升，以穩(wěn)定的幾何級(jí)數(shù)快速增長(zhǎng)，并在8 h后菌液OD600徑直達(dá)到了4.408，此后曲線變化幅度不大，重組菌進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期.

圖3 E.coli BL21 (DE3)/pET 28b-SpoAKR3C2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of E.coli BL21(DE3)/pET 28b-SpoAKR3C2

2.3 最適誘導(dǎo)溫度

誘導(dǎo)溫度是重組蛋白表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因素之一，它對(duì)菌體生長(zhǎng)速率及蛋白的可溶性表達(dá)等有著重要影響[7].重組菌E.coliBL21(DE3)/pET 28b-SpoAKR3C2表達(dá)外源目的蛋白采用二階段發(fā)酵模式，即菌體生長(zhǎng)階段和外源基因表達(dá)階段.由圖4可知：生物量在外源基因表達(dá)階段隨著誘導(dǎo)溫度的升高逐步增加，當(dāng)誘導(dǎo)溫度高于31 ℃后，其菌體濃度的變化趨勢(shì)趨緩；另一方面，在溫度16～34 ℃范圍內(nèi)，均有一定量的外源蛋白表達(dá)，但低溫條件明顯有利于目的蛋白的正確折疊表達(dá)，當(dāng)溫度降低至19 ℃時(shí)，酶活達(dá)到了3.143 U/mg.大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，因此低溫(19 ℃)雖然使得溶解性蛋白的體積酶活力達(dá)到峰值，但不利于菌體的正常生長(zhǎng)代謝.綜合菌體量及其酶活力，確定醛酮還原酶SpoAKR3C2的最適誘導(dǎo)溫度為19 ℃.

圖4 溫度對(duì)醛酮還原酶SpoAKR3C2誘導(dǎo)表達(dá)的影響Fig.4 Effect of temperature on the inducible expression of aldo-keto reductase SpoAKR3C2

2.4 最適誘導(dǎo)時(shí)間

在發(fā)酵過(guò)程中，隨著誘導(dǎo)劑作用時(shí)間的增加，培養(yǎng)液OD600穩(wěn)步上升，而目的蛋白活力在誘導(dǎo)14 h后達(dá)到峰值，延長(zhǎng)至16 h酶活力卻有所下降(圖5).總體而言，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)醛酮還原酶SpoAKR3C2影響顯著，隨著時(shí)間的適當(dāng)延長(zhǎng)，目的蛋白表達(dá)量增加并且不斷累積.因而，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為14 h.

圖5 時(shí)間對(duì)醛酮還原酶SpoAKR3C2誘導(dǎo)表達(dá)的影響Fig.5 Effect of time on the inducible expression of aldo-keto reductase SpoAKR3C2

2.5 最適誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速

宿主菌為E.coliBL21 (DE3)屬于異養(yǎng)兼性厭氧型，研究考察了120～170 r/min范圍內(nèi)轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)醛酮還原酶SpoAKR3C2影響.在發(fā)酵過(guò)程中，隨著誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速的增加，培養(yǎng)液OD600呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這與宿主菌的代謝性質(zhì)相符(圖6).另一原因可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)速增大，使得溶氧供給過(guò)多促使細(xì)胞在早期過(guò)快生長(zhǎng)，進(jìn)而過(guò)多地消耗了培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致后期營(yíng)養(yǎng)不足，從而細(xì)胞生物量較低.而較低的振蕩頻率給菌體提供了一個(gè)低氧的環(huán)境，且其受到的剪切力明顯減少，從而更加有利于目的蛋白的正確折疊、表達(dá).綜合菌體量及其酶活力，確定最佳誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為140 r/min.

圖6 轉(zhuǎn)速對(duì)醛酮還原酶SpoAKR3C2誘導(dǎo)表達(dá)的影響Fig.6 Effect of rotating speed on the inducible expression of aldo-keto reductase SpoAKR3C2

2.6 最適誘導(dǎo)劑濃度

IPTG誘導(dǎo)劑濃度太低，不利于誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，從而影響外源蛋白表達(dá).誘導(dǎo)劑濃度過(guò)高菌體活力下降，比生長(zhǎng)速率降低，也會(huì)導(dǎo)致目的蛋白的表達(dá)量下降[8].本研究考察了誘導(dǎo)劑IPTG濃度對(duì)產(chǎn)醛酮還原酶SpoAKR3C2誘導(dǎo)表達(dá)的影響.相較于誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間這兩個(gè)因素，IPTG濃度對(duì)外源基因的表達(dá)影響略小.當(dāng)IPTG終濃度0.1 mmol/L時(shí)，粗酶液的比活力最高，并且生物量也處于較高的水平(圖7).

圖7 IPTG濃度對(duì)醛酮還原酶SpoAKR3C2誘導(dǎo)表達(dá)的影響Fig.7 Effect of IPTG concentration on the inducible expression of aldo-keto reductase SpoAKR3C2

2.7 最適接種量

采用適合的接種量，在合理地縮短發(fā)酵周期的同時(shí)，又能得到較高的發(fā)酵水平[9].就目的蛋白活力而言，隨著接種量增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在1.5%達(dá)到峰值，隨后逐漸降低(圖8).因而，最適接種量確定為1.5%(體積分?jǐn)?shù)).

圖8 接種量對(duì)醛酮還原酶SpoAKR3C2誘導(dǎo)表達(dá)的影響Fig.8 Effect of inoculation amount on the inducible expression of aldo-keto reductase SpoAKR3C2

3 結(jié) 論

醛酮還原酶SpoAKR3C2具有酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶活力，能催化D-泛解酸內(nèi)酯的不對(duì)稱合成.對(duì)重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-SpoAKR3C2的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳誘導(dǎo)條件：以1.5%接種量進(jìn)行接種，在37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)至菌液OD600為0.6～0.8時(shí)，加入0.1 mmol/L誘導(dǎo)劑IPTG，隨后在19 ℃，140 r/min條件下誘導(dǎo)14 h，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)重組菌過(guò)量表達(dá)目的蛋白.在各影響因素中，誘導(dǎo)溫度及時(shí)間是影響產(chǎn)醛酮還原酶SpoAKR3C2的主要因素.在優(yōu)化的條件下，所得誘導(dǎo)培養(yǎng)物相較于未優(yōu)化前活力提高了約3.4 倍，為該醛酮還原酶在不對(duì)稱合成D-泛解酸內(nèi)酯的進(jìn)一步工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).