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(杭州市余杭區(qū)食品藥品監(jiān)測中心，浙江 杭州 311100)

水果富含水分、糖分、纖維素、維生素和有機(jī)酸等，是公認(rèn)的健康食品.其中的各種有機(jī)酸不僅對水果的風(fēng)味和營養(yǎng)有著重要影響，而且部分有機(jī)酸還有著特殊的功效，如抗氧化、防腐和抑菌等[1].有機(jī)酸是三羧酸循環(huán)中的一個重要生化特征，水果采摘后，其新陳代謝過程依然在繼續(xù)，并且不斷變化，因此，有機(jī)酸也是水果質(zhì)量的動態(tài)判斷指標(biāo)[2].檢測有機(jī)酸的方法有很多，但各有局限.例如滴定法只適合測定總酸[3]；酶學(xué)法適合測定某種特定有機(jī)酸[4]；光譜法通常要進(jìn)行預(yù)衍生化、預(yù)分離等前處理，過程麻煩且能同時分離的有機(jī)酸種類少[5]；由于有機(jī)酸沸點(diǎn)高，不易汽化，因此氣相色譜法準(zhǔn)確度欠佳等[6].

高效液相色譜中的離子交換色譜法對有機(jī)酸的測定比較有優(yōu)勢，準(zhǔn)確、快速、靈敏并能同時分離和測定多種離子[7].宋衛(wèi)得等利用梯度淋洗離子色譜法測定了白酒中26種有機(jī)酸和陰離子[8]，呂洪風(fēng)利用離子色譜保留模型同時檢驗(yàn)果汁中7種有機(jī)酸，對3種不同的蘋果汁進(jìn)行分析,驗(yàn)證了該方法的精準(zhǔn)性和適用性[9]，研究選擇西瓜、菠蘿和枇杷3種水果，應(yīng)用離子交換色譜法測定水果中的有機(jī)酸的變化規(guī)律，為水果質(zhì)量的鑒別提供依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)儀器材料和方法

1.1 原材料

西瓜、菠蘿、枇杷，購于杭州勾莊水果市場.

1.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(均為優(yōu)級純)

乳酸[L(+)Lactic acid]，SUPELCO，99%；草酸[Oxalic acid (Ethanedioic acid) ]，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%；蘋果酸(DL-Malic acid)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%；檸檬酸(Citric acid monohydrate)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%；酒石酸(DL-Tartaric acid)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

ICS3000離子色譜儀，美國戴安公司；Y型精密電子天平，美國雙杰兄弟有限公司；PHILIPS打漿機(jī)，廣州市奇明經(jīng)濟(jì)發(fā)展有限公司；TGL-16M高速立式冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HYJD超純水器，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；水相針式濾器(聚醚砜)，0.22 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；一次性使用1 mL注射器(帶針)，上海康壽醫(yī)療器械有限公司；1 000，200 μL移液槍，上海艾測電子科技有限公司.

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)材料的選擇

選擇成熟度相仿、大小相近、顆粒完整的枇杷，常溫條件陰涼處保存，每隔12 h取樣一次，每次取樣以5個為一組，從外觀上挑選成熟度接近的原料，每次取樣時都去除果皮，盡可能選擇果實(shí)的相同部位.

選擇體積較大的西瓜、菠蘿各一個，選取一圓周，取樣部位都在靠近果皮的一側(cè)，每隔一天取樣一次，取樣后取樣部位用保鮮膜包裹，在常溫下保存，取樣和保存都在超凈臺上完成.

1.4.2 樣品前處理

每隔1 d，分別準(zhǔn)確稱取10 g左右西瓜、菠蘿、枇杷果肉.加90 mL去離子水，研磨，之后在4 ℃，13 000 r/min條件下，離心20 min，取上清液即為提取液.用移液槍移取提取液300 μL、去離子水1 200 μL于試劑瓶中，得到稀釋50倍的樣品溶液，再用0.22 μm的濾膜過濾后供離子色譜進(jìn)樣測試.

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

用電子天平分別稱取檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、乳酸0.050 g，定容至50 mL容量瓶中，配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液.分別用移液槍準(zhǔn)確移取檸檬酸液500 μL、蘋果酸液500 μL、酒石酸液500 μL、乳酸液500 μL和草酸液500 μL，并入100 mL容量瓶中，然后用超純水定容至刻度，從而得到檸檬酸質(zhì)量濃度為5 mg/L、蘋果酸質(zhì)量濃度為5 mg/L、酒石酸質(zhì)量濃度為5 mg/L、乳酸質(zhì)量濃度為5 mg/L和草酸質(zhì)量濃度為5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液.

1.4.4 色譜條件

抑制器膜：ASRS_4 mm；色譜柱：IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm；保護(hù)柱：IonPac AS11-HC 4 mm×50 mm；流動相：KOH (淋洗液自動發(fā)生器產(chǎn)生)，進(jìn)行梯度測試，流速為1.0 mL/min；抑制電流為150 mA；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為50 μL.

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

對比IonPac AS11 4 mm×250 mm和IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm兩種色譜柱的分離效果，可以發(fā)現(xiàn)兩者的離子交換功能基均為帶季銨鹽功能基的陰離子交換樹脂，對OH-的選擇性強(qiáng)，親水性較強(qiáng).但是，IonPac AS11 4 mm×250 mm的柱容量很小，僅有45 μmol/柱；而IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm柱的柱容量較高，達(dá)到了270 μmol/柱，柱容量越大越有利于對乳酸、乙酸等一價有機(jī)酸的保留，色譜出峰時峰形越好，更有利于實(shí)現(xiàn)樣品中多組分的同時分離.另外一方面，通過實(shí)驗(yàn)對比對弱組分的保留情況看，IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm柱對目標(biāo)化合物的分離效果好于IonPac AS11 4 mm×250 mm.所以本實(shí)驗(yàn)選用IonPacAS11-HC 4 mm×250 mm色譜柱.

2.2 流動相與梯度的優(yōu)化

離子交換色譜法分析有機(jī)酸常用稀堿溶液作淋洗液.因OH-為親水性離子，對固定相中的水合區(qū)有著天然的親水性，從而能夠有效地置換其他陰離子.常用氫氧化鈉或氫氧化鉀作淋洗液，因?yàn)镵+的當(dāng)量電導(dǎo)較低，所以本實(shí)驗(yàn)采用KOH作淋洗液.由淋洗液自動發(fā)生器產(chǎn)生，保證了其高純度，避免雜質(zhì)的污染，濃度準(zhǔn)確，流速穩(wěn)定，平衡時間短，降低基線漂移，出峰平直、穩(wěn)定.

實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫技術(shù)，在分離過程中連續(xù)改變流動相中的KOH濃度.分別采用0.6,0.8,1.2,1.6,2.0,10,20,30 mmol/L KOH淋洗液淋洗，發(fā)現(xiàn)淋洗液濃度為30 mmol/L時，檸檬酸較易洗脫，淋洗液濃度為0.8 mmol/L時，乳酸、草酸、酒石酸、蘋果酸能較易洗脫，得到尖銳峰形.經(jīng)過多次試驗(yàn)確定淋洗液KOH濃度梯度程序如表2所示.

在該淋洗條件下，5種有機(jī)酸可實(shí)現(xiàn)基線分離，分離效果如圖1所示.

表1 離子色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of ion chromatography

圖1 5種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 The chromatogram of 5 kinds of mixed organic acid standard solution

分別調(diào)節(jié)流速為0.6,0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL/min，當(dāng)流速增大時，分析時間明顯縮短，但當(dāng)流速大于1.0 mL/min時，5種有機(jī)酸有機(jī)酸會與其中其他的雜質(zhì)峰所重疊，不利于出峰的形狀，當(dāng)流速小于1.0 mL/min時，5種有機(jī)酸的出峰時間延長，但對5種有機(jī)酸的分離度影響并不大.因此，本實(shí)驗(yàn)選用1.0 mL/min的淋洗液流速.

2.3 方法的線性范圍及檢出限

根據(jù)混合標(biāo)準(zhǔn)液出峰值的大小，分別取5種有機(jī)酸儲備液100 μL，稀釋定容于100 mL容量瓶中，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)液.以質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸.同時，按3倍信噪比計算得出檢出限，5種有機(jī)酸的線性方程列于表2.對菠蘿進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，取兩份樣品，一份加標(biāo)，一份對照，重復(fù)測定6次，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn).

由表2可知：該方法所得出的指標(biāo)中，選擇的離子色譜檢測體系對有機(jī)酸的檢測顯示了較高的靈敏度，檢出限較低，精密度好，被測組分的峰面積與進(jìn)樣質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，且線性范圍寬，滿足所測3種水果中有機(jī)酸含量的變化特征的檢測要求.5種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率為95%～100%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)均小于3.0%，該方法具有較好的穩(wěn)定性和回收率.

表2 5種有機(jī)酸的線性范圍、檢出限和回收率Table 2 Linear range,detection limit and recovery rate of 5 kinds of organic acids

2.4 樣品中的有機(jī)酸

按照實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的色譜條件，將處理好的樣品在梯度淋洗離子色譜中得到以下色譜圖，菠蘿樣品見圖2.

圖2 菠蘿樣品中有機(jī)酸的離子色譜圖Fig.2 Ionic chromatograms of organic acids in pineapple

圖中常見的5種有機(jī)酸分離效果良好，圖2為菠蘿樣品的有機(jī)酸色譜圖.圖譜中共有10個峰，可以定性得出，菠蘿中的有機(jī)酸含有蘋果酸、檸檬酸、草酸、乳酸和酒石酸，圖譜中還有5個峰沒有定性，除了第2個未知峰之外，其他峰含量很小，分析可以得出菠蘿中主要有機(jī)酸為檸檬酸和蘋果酸，分別占總酸的67%，26%左右.

由色譜圖的峰面積自動計算得到菠蘿里5種有機(jī)酸含量，見表3.

表3 菠蘿樣品中有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 The content of organic acids in pineapple

圖3為枇杷樣品中有機(jī)酸的離子色譜圖.

圖3 枇杷樣品中有機(jī)酸的離子色譜圖Fig.3 Ionic chromatograms of organic acids in loquat

圖譜中共有9個峰，可以定性得出，枇杷中的有機(jī)酸含有乳酸、草酸、檸檬酸、酒石酸和蘋果酸，其中最主要的是蘋果酸，其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他有機(jī)酸，占總酸的94%左右，其次為酒石酸和草酸.

由色譜圖的峰面積自動計算得到枇杷里5種有機(jī)酸含量，見表4.

表4 枇杷樣品中有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 4 The content of organic acids in loquat

圖4為西瓜樣品中有機(jī)酸的離子色譜圖.

圖譜中共有8個峰，可以定性得出，西瓜果實(shí)中含有的有機(jī)酸為乳酸、草酸、檸檬酸、酒石酸和蘋果酸，其中最主要的是蘋果酸，其含量約占總酸的78.7%，其次是檸檬酸和酒石酸.

由色譜圖的峰面積自動計算得到枇杷里5種有機(jī)酸含量，見表5.

圖4 西瓜樣品中有機(jī)酸的離子色譜圖Fig.4 Ionic chromatograms of organic acids in watermelon

表5 西瓜樣品中有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 The content of organic acids in watermelon

2.5 水果貯藏過程中有機(jī)酸的代謝

有機(jī)酸是水果的一個標(biāo)志性特征成分，因采摘后的水果依然有新陳代謝，所以在水果儲藏期間有機(jī)酸含量是動態(tài)變化的.而且不同水果變化狀況有所區(qū)別的，以下是儲存5 d的水果有機(jī)酸變化情況.

2.5.1 菠 蘿

在保證其他條件一致的前提下，將每天一次采集到的樣品進(jìn)行離子色譜測定，得到相應(yīng)時間段的結(jié)果見表6.

表6 菠蘿果實(shí)貯藏期間有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化情況Table 6 Thecontentoforganic acids in pineapple during storage

由表6可以可知：從含量上看檸檬酸和蘋果酸是菠蘿儲存代謝中的主要有機(jī)酸，其次為草酸和乳酸，酒石酸的含量最少.在5 d的儲藏期內(nèi)，檸檬酸、蘋果酸和總酸都是呈現(xiàn)上升的趨勢，尤其是第5天相比第1天，總酸量高出近一倍，所以菠蘿儲存時間越長酸澀味越強(qiáng)甜度越低也就顯而易見了.草酸、乳酸和酒石酸在5 d的時間內(nèi)，相對來說變化不是很大，對菠蘿口感影響較小.雖然也有其他相關(guān)資料報道菠蘿在貯藏過程中檸檬酸和總酸的含量都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但是與本實(shí)驗(yàn)并不矛盾，因本實(shí)驗(yàn)儲存時間短，只有5 d.之所以這樣考慮，是因?yàn)樽鳛樗称?，新鮮度十分重要，如果儲存過長時間，就會導(dǎo)致水果的腐爛變味甚至無法食用.

2.5.2 枇 杷

與菠蘿相比枇杷更易腐爛，所以在48 h之內(nèi)完成5次采樣，離子色譜測定結(jié)果見表7.

表7 枇杷果實(shí)貯藏期間有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Table 7 The content of organic acids in loquat during storage

由表7可以看出：枇杷中蘋果酸最多，占總酸94%左右，檸檬酸、草酸、乳酸和酒石酸含量較少.在前36 h蘋果酸和總酸含量呈上升趨勢，48 h的數(shù)據(jù)顯示檸檬酸、蘋果酸和總酸含量都在下降，草酸、乳酸和酒石酸略微上升的.這也解釋了為什么枇杷采摘后隨著儲存時間的延長越來越淡而無味.另外隨著枇杷果實(shí)的衰老與腐爛的開始，酸的下降速度加劇，所以如果常溫保存，一般在36 h內(nèi)最好食用完，否則品質(zhì)會急劇下降.

2.5.3 西 瓜

可能因?yàn)槲鞴现杏袡C(jī)酸含量少，測定難度稍大，關(guān)于西瓜中有機(jī)酸含量的測定鮮有報道，未見用離子色譜法測定西瓜中的有機(jī)酸，本實(shí)驗(yàn)對此作了探索.西瓜采樣方法與菠蘿相同，表8是離子色譜法測定的結(jié)果.

表8 西瓜果實(shí)貯藏期間有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Table 8 The content of organic acids in watermelon during storage

由表8可以看出：西瓜中蘋果酸和檸檬酸最多，分別占總酸的73%左右和20%左右，而草酸、乳酸和酒石酸較少.在前3天蘋果酸、檸檬酸和總酸含量呈現(xiàn)上升趨勢，第4天數(shù)據(jù)顯示檸檬酸和總酸在下降，蘋果酸和乳酸卻有上升.可能西瓜在前3天單純處于果實(shí)后熟階段，之后品質(zhì)開始下降，并伴隨著檸檬酸的大量消耗.可見，新鮮西瓜在常溫下放置的時間也不宜過長，一般放置2 d左右西瓜風(fēng)味較好.

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)建立了離子交換色譜法測定菠蘿、枇杷、西瓜中5種有機(jī)酸含量的方法.3種水果中含有多種有機(jī)酸，但經(jīng)過實(shí)驗(yàn)中樣品處理、色譜柱的選擇、梯度淋洗等方法，使得常見有機(jī)酸的極性和離解的難易程度與所測定的5種有機(jī)酸差異很大，所以對5種有機(jī)酸的測定基本沒有影響.實(shí)驗(yàn)證明，選用IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm色譜柱，分別在0.8，30 mmol/L KOH淋洗液條件下以1.0 mL/min的流速進(jìn)行離子色譜法測定5種有機(jī)酸的方法，樣品前處理簡單，操作方法簡便、快捷，線性范圍寬，分析結(jié)果可靠，應(yīng)用范圍廣.3種果實(shí)采摘后，其中的有機(jī)酸的積累仍然沒有停止，在貯藏過程中，枇杷和西瓜果實(shí)中的有機(jī)酸含量都是先增加后降低，主要是檸檬酸的代謝而消耗，菠蘿果實(shí)中的有機(jī)酸含量一直在遞增，說明菠蘿果實(shí)的取樣時間太短，菠蘿果實(shí)還處于后熟的過程，有機(jī)酸的代謝速度慢.3種水果果實(shí)中的有機(jī)酸含量分別為菠蘿>枇杷>西瓜，說明菠蘿的風(fēng)味主要由有機(jī)酸組成，而西瓜的風(fēng)味則主要由果實(shí)中的糖類構(gòu)成，3種果實(shí)的貯存時間長短分別為菠蘿>西瓜>枇杷.