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(1.青島瑯琊臺集團(tuán)股份有限公司,山東 青島 266400;2.中國科學(xué)院 青島生物能源與過程研究所,山東 青島 266101;3.黃島出入境檢驗(yàn)檢驗(yàn)局,山東 青島 266400;4.青島市黃島區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局,山東 青島 266400)

二十碳五烯酸(C20∶5,n-3,EPA),是一種ω-3多不飽和脂肪酸,具有廣泛的生物活性,同時也是一些人體組織細(xì)胞膜的重要組成部分,具有重要的生理功能,已經(jīng)證實(shí)增加EPA的吸收對治療冠狀動脈心臟病、高血壓有效[1].長期以來,EPA主要來源于魚油,但由于漁業(yè)資源的減少以及環(huán)境問題的日益突出,人們開始尋找EPA的替代來源.由于微擬球藻(Nannochloropsissp.)可在很短的生長周期內(nèi)積累大量的EPA,越來越受到關(guān)注,被認(rèn)為是最有潛力的EPA的生產(chǎn)者[2-3].盡管如此,低產(chǎn)量和高成本仍然是微擬球藻大規(guī)模生產(chǎn)EPA的瓶頸.目前,誘變法是獲得高產(chǎn)菌株的有效方法之一.一般而言,誘變方法可分為物理誘變和化學(xué)誘變兩大類[4].重離子誘變是一種新的物理誘變技術(shù),與傳統(tǒng)的誘變源(主要為γ射線和X射線)相比,重離子輻射具有獨(dú)特的優(yōu)勢[5-6],如:1) 傳能線密度(Linear energy transfer, LET)高,使生物介質(zhì)產(chǎn)生高密度的電離和激發(fā)事件,從而容易產(chǎn)生突變體;2) 可使得生物樣品局部受損,這種局部受損的位置可隨離子能量的高低而變化,是可控的,可實(shí)現(xiàn)定位誘變、定向育種;3) 對生物體產(chǎn)生的總體生理損傷相對較小,且損傷后修復(fù)效應(yīng)小,可產(chǎn)生大量的穩(wěn)定的突變體;4) 相對生物效應(yīng)(Relative biological effectiveness, RBE)大,因此對生物誘變作用強(qiáng)、誘發(fā)突變譜廣、突變率高.快速識別和篩選高產(chǎn)突變體也是育種研究的重要課題.定向篩選比隨機(jī)選擇更有效,可以減少工作量.脂肪酸合酶(FAS)是微擬球藻合成EPA的關(guān)鍵酶之一,增強(qiáng)脂肪酸合酶的活性有可能提高EPA的產(chǎn)量.三氯生具有廣譜抗菌作用,可通過抑制fabI基因位點(diǎn)抑制FAS的活性[7].通常在一定濃度的三氯生培養(yǎng)基上生長的突變體可以被鑒定為具有相對較高的FAS活性,使它們成為脂質(zhì)生產(chǎn)的良好候選.

在本研究中,首先采用重離子束輻照對微擬球藻野生藻株進(jìn)行誘變,隨后,利用三氯生對突變體進(jìn)行定向篩選,取代了之前的隨機(jī)選擇方法,大大提高了篩選效率.

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)藻種來源于中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所的藻株庫,藻株為微擬球藻NannochloropsisoceanicaSD595.培養(yǎng)基為BG-11海水培養(yǎng)基:NaNO31.5 g/L,K2HPO4400 mg/L,MgSO4·7H2O 375 mg/L,CaCl2·2H2O 180 mg/L,Na2CO3100 mg/L,檸檬酸30 mg/L,檸檬酸鐵銨24 mg/L,海水晶15 g/L,ZnSO4·7H2O 0.222 mg/L,CuSO4·5H2O 0.079 mg/L,MnCl2·4H2O 1.81 mg/L,Na2MoO4·2H2O 0.39 mg/L,Co(NO3)4·6H2O 0.0494 mg/L,H3BO32.86 mg/L,Na2EDTA 5 mg/L.培養(yǎng)溫度25 ℃,光強(qiáng)為150 μmol/(m2·s).

1.2 重離子束輻照和三氯生聯(lián)合篩選

為了獲得穩(wěn)定、高產(chǎn)的EPA藻株,整個實(shí)驗(yàn)包括四步篩選程序.詳細(xì)的過程如下所述：

第一步,制備細(xì)胞懸浮液.首先將SD595藻株預(yù)培養(yǎng)48 h使其細(xì)胞數(shù)量達(dá)到106～107個/mL,取10 mL微藻培養(yǎng)液,在離心力8 000g條件下離心10 min,棄去上清,在同樣條件下用去離子水清洗1 次后,用10 mL 0.9%的生理鹽水重懸混勻待用.

第二步,在中國科學(xué)院現(xiàn)代物理研究所的蘭州重離子加速器國家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了重離子光束輻照實(shí)驗(yàn).輻照條件為12C6+重離子束,能量為80 MeV/μ,輻照劑量為40,80,120,160,200 Gy.輻照后懸浮液稀釋至3份,取100 μL懸浮液涂在BG11固體平板培養(yǎng)基上.在25 ℃條件下,黑暗中孵育4 d,計(jì)算死亡率,確定最佳輻照劑量(致死率在70%左右).死亡率=(對照組平板菌落數(shù)-輻照組平板菌落數(shù))÷對照組平板菌落數(shù)×100%.

第三步,確定最佳抗菌劑三氯生的質(zhì)量濃度.分別取100 μL待用的微擬球藻懸浮液涂布于含有不同三氯生質(zhì)量濃度(0,0.1,0.5,0.6,0.8,1.0,1.5,2,2.5,3 mg/L)的BG11平板培養(yǎng)基上,25 ℃孵育4 d,分別計(jì)算死亡率,確定最佳三氯生質(zhì)量濃度.

第四步,將經(jīng)過最佳輻照條件下輻照的微藻培養(yǎng)液100 μL涂布于含有最佳三氯生濃度的平板上.25 ℃孵育4 d后,選取突變體測試其生長特性及EPA的產(chǎn)量.

1.3 生物量的測定

培養(yǎng)物經(jīng)8 000g離心10 min后,棄上清,加入等體積去離子水洗滌1次,-40 ℃真空冷凍干燥48 h,稱其干質(zhì)量[8].生物量=干質(zhì)量÷培養(yǎng)物體積.

1.4 油脂的提取

稱取100 mg的藻粉,加入600 μL 6 mol/L鹽酸,振蕩混勻,沸水浴煮5 min,-20 ℃速冷后加入900 μLV(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1的混合溶劑,5 000g離心5 min,取氯仿層,加600 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化鈉溶液,混勻,5 000g離心5 min,取氯仿層移至干燥的試管中,揮發(fā)除去氯仿,得到油脂,然后50 ℃真空干燥至恒重,稱量[9].含油率=油脂質(zhì)量÷藻粉質(zhì)量×100%.

1.5 油脂中EPA含量的測定

將提取的油脂溶解于1 mL氯仿中,加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的硫酸-甲醇溶液,85 ℃水浴加熱2.5 h,冷卻至室溫,加入1 mL正己烷和1 mL飽和氯化鈉溶液,混勻,靜置分層后取上層,經(jīng)0.22 μm尼龍膜過濾后,進(jìn)行氣相色譜檢測[10].色譜條件:Agilent GC-6890型氣相色譜儀,色譜柱HP-INNOWax(30 m×250 μm×0.25 μm,安捷倫公司).采用程序升溫,初始溫度100 ℃,按15 ℃/min升到240 ℃,保持10 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃;FID檢測器,檢測器溫度260 ℃[11].

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 最佳輻照劑量的確定

重離子誘變已經(jīng)成功地應(yīng)用于植物[12]和一些工業(yè)微生物誘變育種項(xiàng)目[13-14].由于缺乏微擬球藻重離子誘變的參考條件,本實(shí)驗(yàn)研究了5種輻照劑量的致死率,如圖1所示.在40,80,120,160,200 Gy時,死亡率分別為45%,77%,89%,95%和99%.隨著劑量的增加,細(xì)胞的致死率增加,在80 Gy時急劇增加到77%.一般而言,致死率為70%～80%時,會產(chǎn)生較高的陽性突變率[6].因此,在本研究中,重離子束輻照誘變在80 Gy劑量下進(jìn)行.

圖1 不同輻照劑量對微擬球藻的致死效果Fig.1 The lethal effects of different irradiation doses on Nannochloropsis

2.2 最佳三氯生篩選質(zhì)量濃度的確定

三氯生可抑制脂肪酸合成過程中fabI基因位點(diǎn),而能在含有三氯生的培養(yǎng)基中生長的菌落被認(rèn)為具有較強(qiáng)的脂肪酸合成活性[7].Cheng等的工作證明:突變株在含有三氯生的培養(yǎng)基上生長時,其致死率達(dá)到90%左右時,存活的突變株將有較大幾率具有較強(qiáng)的脂肪酸合成活性[15].因此,為了確定野生型藻株對三氯生的敏感性,筆者將微擬球藻SD 595分別涂布到含有不同三氯生質(zhì)量濃度的平板上.結(jié)果發(fā)現(xiàn)三氯生能抑制SD 595藻株的生長,隨著三氯生質(zhì)量濃度的增加,藻落數(shù)減少.當(dāng)三氯生質(zhì)量濃度為2 mg/L時,致死率約為93%(圖2).因此,在重離子束輻照誘變后,選擇2 mg/L的三氯生作為篩選突變體的合適質(zhì)量濃度.

圖2 三氯生對微擬球藻的致死效果Fig.2 The lethal effect of triclosan on Nannochloropsis

2.3 高產(chǎn)EPA的微擬球藻突變株的篩選

將經(jīng)過輻照劑量為80 Gy的重離子束處理的細(xì)胞液梯度稀釋,涂布到含有質(zhì)量濃度為2 mg/L的三氯生的BG11培養(yǎng)基平板中,25 ℃孵育4 d.Cheng等的研究證明:只有高脂肪酸合酶(FAS)活性的突變株可以成長,形成較大的菌落[15].隨機(jī)選取了150個大的菌落,在含有質(zhì)量濃度為2 mg/L的三氯生的平板上進(jìn)行了3次復(fù)篩，53個突變體仍然能夠穩(wěn)定地生長.進(jìn)一步篩選出19株具有高脂質(zhì)和EPA含量的藻株，如圖3所示.突變M44的EPA產(chǎn)量最高,脂質(zhì)和EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為42.9%和43.3%,分別比出發(fā)藻株SD 595提高39.3%和48.3%.脂肪酸組成分析(表1)發(fā)現(xiàn):突變M44的EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高,從29.2%到43.3%;C16∶0,C16∶1和C18∶1的比例顯著下降.

1—SD595;2—M5;3—M6;4—M9;5—M12;6—M13;7—M18;8—M21;9—M22;10—M24;11—M27;12—M30;13—M33;14—M34;15—M36;16—M42;17—M43;18—M44;19—M46圖3 株高產(chǎn)藻株與出發(fā)藻株SD595油脂和EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較Fig.3 Comparison of the lipid and EPA contents between SD595 and 19 mutants

表1 突變藻株M44與出發(fā)藻株SD595的脂肪酸組成比較 Table 1 Comparison of the fatty acid composition between strain M44 and SD595

2.4 遺傳穩(wěn)定性檢測

將藻株M44在BG11培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)10次,每5代測定其生物量、油脂和EPA產(chǎn)量.如表2所示,在傳代10次后EPA質(zhì)量濃度大約維持在2.5 g/L左右,生物量穩(wěn)定在13 g/L左右,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,M44菌株第1代與第5代及第10代間EPA產(chǎn)量沒有顯著性差異,表明突變藻株M44具有良好的遺傳穩(wěn)定性.

3 結(jié) 論

相比與傳統(tǒng)的物理誘變(如紫外線、γ和X射線),重離子束輻照誘變具有更高的傳能線密度,能引起更多的生物損傷且難以修復(fù),造成的突變相對穩(wěn)定[16].如何有效地從大量突變體中篩選出高產(chǎn)菌株是誘變育種中的關(guān)鍵問題[17].當(dāng)添加三氯生作為篩選壓力進(jìn)行定向選育高效脂肪酸合成菌株時,能大大提高正突變株的篩選效率.從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,使用三氯生篩選法后,所有53種突變體中篩選的19株突變藻株的EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)至少增加了30%,陽性突變率為38%,大大提高了工作效率.綜上所述,采用重離子束輻照聯(lián)合三氯生處理的方法定向篩選高產(chǎn)EPA的微擬球藻藻株,是一種有效的育種方法.

表2 突變藻株M44遺傳穩(wěn)定性考察Table 2 Genetic stability of mutant M44