梁安莉，農(nóng)珍妮，楊江夏，黃 彥

(1廣西民族大學(xué)相思湖學(xué)院，南寧 530008；2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，山東青島 266071；3廣西疾病預(yù)防控制中心，南寧 530028)

目前認(rèn)為克羅諾桿菌屬包括7個(gè)種：阪崎克羅桿菌、丙二酸鹽克羅諾桿菌、尤尼沃思克羅諾桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、莫金斯克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌和康帝蒙提克羅諾桿菌[1-6]。克羅諾桿菌屬對環(huán)境耐受，不同種間具有不同的毒力特性[7]，是一種條件致病菌。臨床病例和分子生物學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，C.sakazakii具有更強(qiáng)致病力。6月齡以下的嬰幼兒和60歲以上的成人易感，其臨床癥狀主要為致命性的壞死性結(jié)腸炎、腦膜炎、敗血癥等。6月齡以下的早產(chǎn)兒感染該菌的死亡率高達(dá)40%～80%[8-10]。世界衛(wèi)生組織和多個(gè)國家已將其列為引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌，要求在嬰兒配方奶粉中不得檢出[11-12]。我國高度重視克羅諾桿菌污染情況的監(jiān)控，將其列入食源性致病菌的監(jiān)測范圍[7]。據(jù)報(bào)道，嬰兒配方奶粉的克羅諾桿菌污染被認(rèn)為是引起嬰兒發(fā)病的主要原因[13-14]。此外，各種母乳替代用品也是克羅諾桿菌污染源之一[15-17]。目前，市售的嬰幼兒米粉為了增加營養(yǎng)常加入一些營養(yǎng)添加成分，而蔬果、淮山、乳粉等原料均是克羅諾桿菌污染來源[18]，增加了感染的風(fēng)險(xiǎn)。為了了解目前市售嬰幼兒配方米粉受克羅諾桿菌的污染情況，及不同添加營養(yǎng)成分與污染是否具有相關(guān)性，本研究對廣西區(qū)市售不同配方的嬰幼兒米粉受克羅諾桿菌種屬污染的情況進(jìn)行調(diào)查鑒定。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

在廣西區(qū)內(nèi)超市購買不同品牌、不同批次嬰幼兒米粉共125份，其中純營養(yǎng)米粉25份(未添加其他配料原料的)、添加淮山(淮蓮)粉的46份、添加蔬果粉的20份、添加高蛋白乳粉的34份。

1.2 克羅諾菌分離培養(yǎng)

按照2007年Iversen的方法進(jìn)行菌株的分離培養(yǎng)[19]，無菌稱取100 g樣品，充分溶于900 mL 緩沖蛋白胨水(北京路橋)的三角瓶中，置于37℃ 培養(yǎng)18 h，移取1mL的增菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至10 mL 萬古霉素改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(北京路橋)，44℃培養(yǎng)24 h后，在阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基(青島海博)上劃線轉(zhuǎn)種，37℃培養(yǎng)24 h。挑取顯色培養(yǎng)基中的藍(lán)綠色菌疑似菌落進(jìn)行下一步純化鑒定。

1.3 克羅諾菌屬鑒定

純化后的疑似菌株用VITEK 2 compact 生化鑒定儀 (bioMèrieix，法國)進(jìn)行克羅諾菌屬鑒定，對照菌株阪崎克羅諾桿菌ATCC 25944 購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌株庫。

1.4 fusA基因測序

用DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)提取細(xì)菌基因組DNA。fusA基因擴(kuò)增參照Baldwin方法進(jìn)行[20]，引物fusA-F：5’-GAAACCGTATGGCGTCAG-3’和fusA-R：5’-AGAACCGAAGTGCAGACG-3’，PCR 用擴(kuò)增試劑盒(Qiagen，US)，反應(yīng)體系為 50 μL：10μL Q solution、4 μL模板 (5～10 ng/μL)、2 μL的fusA-F引物(10 μmol/L)、2 μL的fusA-R引物(10 μmol/L)、5 μL 10×PCR緩沖液 (含15 mmol /L MgCl2)、1 μL dNTP Mix 溶液 (每種10 mmol /L)、0.25 μL Taq聚合酶(5 U)和25.75 μL去離子水。擴(kuò)增條件：95℃ 預(yù)變性 3 min、95℃ 變性 1 min、58℃ 退火 1 min、72℃ 延伸 2 min，循環(huán) 30 次；最后 72℃ 延伸 5 min。PCR 產(chǎn)物用 1% 瓊脂糖電泳，電泳條件電泳條件為 1 × TAE 電泳緩沖液，電壓40 V/cm，電泳 2 h，在紫外光下切膠回收，送生工生物(上海)有限公司雙向測序。

1.5 細(xì)菌種類鑒定和進(jìn)化樹構(gòu)建

獲得的fusA基因序列在多位點(diǎn)序列分型(MLST)數(shù)據(jù)庫中 http：//pubmlst.org/cronobacter/info/protocol.shtml 進(jìn)行種類鑒定和等位基因序列的查找，并用Mega 7 最大似然算法構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果和分析

2.1 感染情況

經(jīng)增菌培養(yǎng)、顯色培養(yǎng)基分離、克羅諾菌屬鑒定，20株米粉樣品確定為克羅諾桿菌屬，總污染率為16.00%，其中淮山(淮蓮)營養(yǎng)配方米粉污染率最高，為26.09%，其他添加配方的營養(yǎng)米粉污染率均比未添加的營養(yǎng)米粉的高(附表)。

2.2 菌株鑒定和進(jìn)化分析

通過fusA基因序列在MLST數(shù)據(jù)庫中比對鑒定，20株陽性菌包含4個(gè)不同種克羅諾桿菌，其中C.sakazakii14株、C.malonaticus3株、C.dublinensis2株、C.muytjensii1株。構(gòu)建的進(jìn)化樹以克氏檸檬酸桿菌為外群，發(fā)現(xiàn)這4種不同的克羅諾桿菌獨(dú)立成群(附圖)。本調(diào)查表明，在嬰幼兒營養(yǎng)米粉中主要流行的為C.sakazakii，與國內(nèi)外報(bào)道在植物性原材料、食品中致病能力較強(qiáng)的C.sakazakii是克羅諾桿菌屬主要的污染源相一致[5.20-22]。

附表 不同配方米粉克羅諾桿菌感染情況

附圖 米粉中分離的20株克羅諾桿菌的進(jìn)化分析

3 討論

本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，廣西區(qū)內(nèi)DRP受克羅諾桿菌污染較為嚴(yán)重，且添加營養(yǎng)成分的嬰幼兒米粉污染率比單純的營養(yǎng)米粉要高：添加果蔬的配方米粉的污染率約為單純的營養(yǎng)米粉的2倍，添加淮山、淮蓮粉的配方米粉的污染率約為單純的營養(yǎng)米粉的3倍。分析其主要原因?yàn)椋?1)可能與添加的植物性營養(yǎng)成分本身是克羅諾桿菌的重要來源[23-28]有關(guān)。已有研究者通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了克羅諾桿菌能存在于25℃采摘的新鮮蔬果，并大量繁殖[10]。陳萬義等[29]調(diào)查上海102份蔬菜中克羅諾桿菌菌株，確定13份樣品污染，分離率高達(dá)13%(13/102)；此外，植物性原料的較高的污染率可能與種植過程、運(yùn)輸和加工環(huán)節(jié)有關(guān)。(2)可能與嬰幼兒米粉的生產(chǎn)工藝有關(guān)。為了更好地保持添加原料中的營養(yǎng)成分，添加成分往往在添加前沒有進(jìn)行相應(yīng)的滅菌處理，缺乏相應(yīng)的添加原料安全合格檢測指標(biāo)，且目前企業(yè)在混合添加的過程中，主要采取預(yù)處理-混合添加-微波消毒的工藝方式，而克羅諾桿菌耐干燥、耐高溫，形成生物膜后粘附能力強(qiáng)的特點(diǎn)，該加工工藝有滅菌不徹底的風(fēng)險(xiǎn)[28]。

為了降低克羅諾桿菌對DRP的污染風(fēng)險(xiǎn)，我們建議生產(chǎn)企業(yè)從原材料的質(zhì)量監(jiān)控、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)、運(yùn)輸設(shè)備、包裝各個(gè)環(huán)節(jié)著手做好監(jiān)控：(1)嚴(yán)把原材料關(guān)：對生產(chǎn)原料實(shí)行嚴(yán)格的質(zhì)量監(jiān)控，做好質(zhì)量安全檢測。(2)優(yōu)化生產(chǎn)工藝：繼續(xù)做好生產(chǎn)流程優(yōu)化、監(jiān)控外，上市前進(jìn)行有效的抽檢；(3)生產(chǎn)企業(yè)要制定和嚴(yán)格實(shí)施清潔、消毒管理制度，對生產(chǎn)設(shè)備和運(yùn)輸設(shè)備進(jìn)行定期、有效的清潔和消毒；(4)嚴(yán)格執(zhí)行國家的食品包裝要求，在產(chǎn)品包裝上，尤其應(yīng)對沖調(diào)方法、喂養(yǎng)注意事項(xiàng)進(jìn)行說明，建議用高溫(70℃以上)水沖調(diào)米粉[16，沖調(diào)后盡快喂食。◇