李瑩瑩 王琳琳 馬琳琳 王 語 肖丹丹 張曉萍 于向民 荊 昭 李 玲

(青島大學(xué)人體解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)系, 青島 266071)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種常見的慢性炎癥疾病[1],是多數(shù)心血管疾病的病理基礎(chǔ),心血管疾病死亡率上升主要是由于動脈粥樣硬化性血管疾病死亡率上升所造成[2]。染料木黃酮是最活躍的天然黃酮類化合物,具有多種生物學(xué)作用,包括抗氧化、抗增殖和抗腫瘤功能等[3]。染料木黃酮作為一種非特異性酪氨酸激酶抑制劑,因其在生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)方面對人類某些心血管疾病,尤其是動脈粥樣硬化具有潛在的價值,所以備受科研工作者關(guān)注[4]。蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)是絲氨酸/蘇氨酸激酶,參與細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞凋亡等生理活動,能夠促進細(xì)胞存活和增殖[5]。目前,染料木黃酮對動脈粥樣硬化作用的機制尚不明確。本實驗主要探究了染料木黃酮對小鼠動脈粥樣硬化的治療作用及其相關(guān)作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

小鼠高脂飼料(0.25%膽固醇+15%脂肪)、普通飼料購買于北京華阜康生物科技股份有限公司;染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(Genistein, GST)由大連市美侖生物技術(shù)公司提供;飽和油紅O染色液(oil red O solution)購于索萊寶公司;鼠源p-Akt單克隆抗體購于Santa Cruz公司;兔源Akt單克隆抗體、兔源β-actin單克隆抗體購于北京博奧森公司。

1.2 動脈粥樣硬化小鼠模型的制備

雄性6周齡C57BL6小鼠50只,體質(zhì)量17～22g,先以普通飼料喂養(yǎng)1周后隨機分5組,每組10只： 低濃度染料木黃酮組(左頸總動脈套管+高脂飼料+染料木黃酮5mg·kg-1·d-1)、高濃度染料木黃酮組(左頸總動脈套管+高脂飼料+染料木黃酮20mg·kg-1·d-1)、阿托伐他汀鈣組(左頸總動脈套管+高脂飼料+阿托伐他汀鈣10mg·kg-1·d-1)及模型組(左頸總動脈套管+高脂飼料+生理鹽水)、空白對照組10只(普通飼料+生理鹽水)。藥品均為灌胃處理,室溫19℃～22℃,自然采光,自由飲水,每周測量體質(zhì)量并記錄。

1.3 血液和動脈樣本的采集

實驗第15周,小鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉,股動脈取血,解剖小鼠,取左頸總動脈1.5～2.0cm,浸入4%多聚甲醛固定。

1.4 血脂檢測

取血清,送至青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科檢測血脂高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血清總膽固醇和甘油三酯含量。

1.5 病理學(xué)觀察

將4%多聚甲醛固定的小鼠頸總動脈一部分脫水透明后用石蠟包埋,以厚度為5μm連續(xù)切片后H-E染色。另一部分4%多聚甲醛固定的頸總動脈用OCT包埋劑包埋后進行連續(xù)冰凍切片,厚度約0.6mm,切片后油紅O染色。

1.6 蛋白印跡檢測p-Akt蛋白表達(dá)

高速組織研磨機研磨各小組頸總動脈組織,加入含有 PMSF和磷酸酶抑制劑的高效 RIPA蛋白酶裂解液提取頸總動脈總蛋白,BCA試劑盒測定蛋白濃度。每組上樣量為10μg,經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳后,采用濕轉(zhuǎn)法恒壓1h將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。5%脫脂奶粉置于搖床上封閉1h,洗膜,加入一抗 p-Akt(1∶600)和β-actin(1∶1500),4℃孵育過夜,洗膜,加羊抗鼠二抗(1∶5000)室溫孵育1h后,洗膜。PVDF膜上滴入超敏化學(xué)發(fā)光試劑ECL并反應(yīng)2min,用VILBER Fusion FX7成像系統(tǒng)調(diào)節(jié)曝光時間成像。成像后用一抗二抗去除液漂洗 PVDF膜,加入TBST漂洗,再次封閉1h,洗膜,加入一抗 Akt(1∶600),以后步驟同上。各組條帶用Image-J分析灰度值。

1.7 免疫熒光檢測p-Akt蛋白表達(dá)

從-20℃冰箱取出6μm的凍干切片并立刻放入雙蒸水中浸泡10min, PBS洗片,后吸干組織周圍的水分,使載玻片干燥。將切片放入濕盒,用10%的羊血清溶液在室溫下封閉1h。吸干封閉液,用足量的p-Akt一抗溶液完全浸沒切片入濕盒4℃過夜。PBS洗片,切片在濕盒中與相應(yīng)的熒光抗體室溫孵育2h。用足夠量的熒光二抗(1∶250)溶液完全浸沒切片。PBS洗片,將切片孵育核染DAPI約15min。PBS洗片,切片干后,滴加少許抗熒光淬滅劑,緩慢蓋上蓋玻片。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量變化

5組小鼠體質(zhì)量在手術(shù)后1～2周略有下降,3～8 周體質(zhì)量增長較快,此后體質(zhì)量呈緩慢增長。實驗期間各組間小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 5組小鼠體質(zhì)量變化

2.2 血脂檢測

空白對照組,高、低濃度染料木黃酮,阿托伐他汀鈣組與模型組之間血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，染料木黃酮對于血清中總膽固醇含量無明顯影響(P>0.05),低濃度染料木黃酮組對于血清中低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的影響不明顯(P>0.05)。

2.3 H-E染色組織形態(tài)學(xué)

連續(xù)石蠟切片后H-E染色,通過光學(xué)顯微鏡觀察并記錄小鼠頸總動脈套管側(cè)組織學(xué)變化(圖2)。頸總動脈空白對照組(圖2A1)內(nèi)膜光滑,血管管壁薄,管腔內(nèi)無明顯變化,模型組(圖2E1)內(nèi)膜有斑塊形成,血管管壁略厚。阿托伐他汀鈣對照組(圖2B1),低、高濃度染料木黃酮組(圖2C1、D1)相比無明顯區(qū)別。

表1 各組小鼠血脂變化結(jié)果(n=10,±s, mmol/L)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group

2.4 油紅O染色組織形態(tài)學(xué)

連續(xù)冰凍切片油紅O染色,通過光學(xué)顯微鏡觀察并記錄小鼠頸總動脈套管側(cè)脂滴含量變化?？瞻讓φ战M(圖2A2)、阿托伐他汀鈣組(圖2B2)、高濃度染料木黃酮組(圖2D2)組織內(nèi)無明顯脂滴,低濃度染料木黃酮組(圖2C2)組織內(nèi)含有少量脂滴,模型組(圖2E2)頸總動脈組織內(nèi)脂滴含量相對較高。

2.5 免疫印跡檢測增殖相關(guān)蛋白Akt表達(dá)情況

對免疫印跡圖像(圖3)灰度值分析顯示(圖4),低、高濃度染料木黃酮組的蛋白表達(dá)量與空白對照組相比,高濃度染料木黃酮組與空白對照組相似,低濃度染料木黃酮組蛋白表達(dá)量明顯高于空白對照組(P<0.01)。低濃度染料木黃酮組p-Akt蛋白表達(dá)量明顯高于阿托伐他汀鈣組(P<0.01)。高濃度染料木黃酮組p-Akt蛋白表達(dá)量明顯低于模型組,低濃度染料木黃酮組 p-Akt蛋白表達(dá)量低于模型組(P<0.01)。據(jù)此推斷,高濃度染料木黃酮組對于小鼠動脈粥樣硬化有明顯的治療效果。

圖3 免疫印跡檢測p-Akt蛋白含量的表達(dá)

2.6 免疫熒光檢測增殖相關(guān)蛋白Akt的表達(dá)

實驗結(jié)果(圖4、5)表明,免疫熒光檢測p-Akt表達(dá)變化趨勢與免疫印跡檢測結(jié)果基本一致。即高、低濃度染料木黃酮組和模型組相比較,p-Akt在高濃度染料木黃酮組的小鼠血管細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯降低(P<0.05)。高、低濃度染料木黃酮組和空白對照組、阿托伐他汀鈣組相比較,p-Akt在低度染料木黃酮組的小鼠血管細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯增多(P<0.05)。高濃度染料木黃酮組可有效抑制p-Akt的表達(dá),對于小鼠動脈粥樣硬化有明顯的治療效果。

圖5 p-Akt蛋白表達(dá)在各組小鼠頸總動脈中的變化

3 討論

動脈粥樣硬化是對人類的健康影響最嚴(yán)重、最常見的慢性病之一[6]。同時,動脈粥樣硬化還是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ),全球每年大約2000萬人死于動脈粥樣硬化的相關(guān)疾病[7]。

頸總動脈內(nèi)置鞘管法可改變血流動力學(xué),使血管壁的剪切力發(fā)生一定的改變[8],是構(gòu)建小鼠動脈粥樣硬化動物模型的一種造模方法[9]。

動脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生學(xué)說之一是血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖以及脂質(zhì)的過氧化損傷。動脈粥樣硬化的病變閉塞是由于動脈內(nèi)膜厚度的增加,而其厚度增加是由于血管平滑肌細(xì)胞的大量增加,這些血管平滑肌細(xì)胞能夠形成新的結(jié)締組織,從而導(dǎo)致高血脂癥個體的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外脂質(zhì)積累。血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖在動脈粥樣硬化的發(fā)生中起至關(guān)重要的作用。在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞存活和細(xì)胞增殖等過程中,Akt信號通路都發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。此外,Akt 信號通路介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)也是非常重要的免疫反應(yīng)通路,能夠調(diào)節(jié)炎癥因子分泌[10]。在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中,氧化應(yīng)激、氧化低密度脂蛋白及炎癥因子導(dǎo)致p-Akt 迅速失活,凋亡相關(guān)基因的表達(dá)升高,進而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;此外,血管平滑肌的遷移、增殖表型轉(zhuǎn)換以及泡沫細(xì)胞的形成等都和磷酸化Akt的活性相關(guān)聯(lián)[11]。Akt的表達(dá)在動脈粥樣硬化 的發(fā)生和發(fā)展進程中起著十分重要的作用[11],通過抑制Akt信號通路,可延緩動脈粥樣硬化的形成及發(fā)展。

盡管動脈粥樣硬化發(fā)生在血管內(nèi)壁,但沒有直接針對血管壁進行預(yù)防的臨床藥物。動脈粥樣硬化形成的過程中,需要新的靶分子提供治療靶點。目前,他汀類藥物是臨床上常用的降脂藥物,具有多種藥理作用,可以降低心血管疾病的風(fēng)險[12-14]。諾華生物醫(yī)學(xué)研究院認(rèn)為： 盡管他汀類藥物在治療動脈粥樣硬化方面療效顯著,但仍有一部分患者的病情繼續(xù)惡化。因此,尋找其他類別或能夠輔助抑制動脈粥樣硬化的新型臨床藥物是有必要的。

相對男性而言,女性心血管疾病死亡率較低,其中部分原因是由于女性雌激素表達(dá)水平較高。許多研究表明雌激素具有多種生物學(xué)效應(yīng),能夠減輕動脈粥樣硬化[15]。染料木黃酮是存在于大豆異黃酮中的重要活性元素,是大豆異黃酮產(chǎn)品中的主要功能成分,屬于植物雌激素的一種,在結(jié)構(gòu)上與17β-雌二醇類似,植物雌激素具有抗動脈粥樣硬化的作用[16]。目前,染料木黃酮對于動脈粥樣硬化的治療作用研究較少,且作用的機制尚不明確。本實驗主要探究了染料木黃酮對于小鼠動脈粥樣硬化的治療作用及相關(guān)作用機制。

研究表明阿托伐他汀鈣[17]和染料木黃酮[18]能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。本實驗選取阿托伐他汀鈣作為陽性對照組,同樣證明模型組及他汀組血總膽固醇、甘油三酯及低濃度脂蛋白水平高于對照組,而他汀組血脂水平低于模型組。低、高濃度染料木黃酮組中總膽固醇含量均沒有明顯變化;高濃度染料木黃酮組的高密度脂蛋白含量要高于模型組,效果和阿托伐他汀鈣組相近,但低濃度染料木黃酮組沒有明顯效果。本研究證明,高濃度染料木黃酮干預(yù)組可以有效降低甘油三酯,低密度脂蛋白的含量,同時提高高密度脂蛋白在血清中的含量,且治療效果與阿托伐他汀鈣組(10mg·kg-1·d-1)相近。

染料木黃酮可以抑制血管炎癥,主要是通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-B(nuclear factor kappa B, NF-κB)[19]、核因子E2相關(guān)因子2/血紅素氧合酶-1 (nuclear factor-E2-related factor 2/heme oxygenase-1, Nrf2/HO-1)[20]、磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)[15]和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)[21]信號通路實現(xiàn)的。阿托伐他汀鈣藥物治療動脈粥樣硬化可以減少斑塊的形成[22],研究表明此類藥物對平滑肌細(xì)胞的增殖也起到了明顯的抑制作用[23],其可能機制是抑制 p-Akt的活性。血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移是動脈粥樣硬化引起血管損傷和再狹窄的一個原因。在動脈粥樣硬化發(fā)展之初血管平滑肌細(xì)胞從收縮型變成分泌型,并遷移到血管內(nèi)膜從而導(dǎo)致內(nèi)膜的增生[15,23]。平滑肌細(xì)胞的異常增殖和Akt信號通路關(guān)系密切,筆者推測染料木黃酮可在體內(nèi)通過抑制p-Akt,進而對動脈粥樣硬化起治療作用。本研究選取阿托伐他汀鈣作為陽性對照組,比較不同濃度的染料木黃酮的體外藥用效果。本研究通過比較不同劑量的染料木黃酮在小鼠體內(nèi)的藥用效果顯示,Akt信號通路在小鼠動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,高濃度染料木黃酮可以有效地抑制p-Akt的表達(dá),其抑制效果和阿托伐他汀鈣的小鼠體內(nèi)藥用效果相近。

綜上所述,染料木黃酮在小鼠體內(nèi)通過降低血脂水平,下調(diào)p-Akt的表達(dá),減少血管內(nèi)斑塊的形成,發(fā)揮一定的抗動脈粥樣硬化的作用。染料木黃酮在防治動脈粥樣硬化中具有重要的潛在臨床藥用價值。