高賽紅 張小良 楊迎春 任占川

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院, 汾陽 032200)

腦缺血再灌注損傷威脅患者生命并影響其生活質(zhì)量,如何減輕再灌注損傷,成為目前研究熱點(diǎn)之一。國內(nèi)外研究[1-2]表明,p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase, p38MAPK)信號通路與腦缺血再灌注損傷有著非常緊密的關(guān)系,幾乎參與了缺血性腦損傷的全部病理生理過程。同時(shí)p38MAPK信號通路也是參與血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)破壞的關(guān)鍵途徑[3]。基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)參與腦缺血再灌注損傷中BBB的破壞,主要表現(xiàn)為降解Ⅳ型膠原破壞基底膜[4]。李國輝等[5]報(bào)道在腦缺血再灌注損傷過程中阻斷p38MAPK通路的過激活,可下調(diào)MMP-9的高表達(dá),減輕血腦屏障破壞。此外,本課題組前期研究結(jié)果[6-7]表明p38MAPK和MMP-9均參與高脂血癥加重腦缺血再灌注損傷,但在高脂血癥加重再灌注損傷過程中,抑制p38MAPK表達(dá)活化是否能明顯抑制MMP-9表達(dá)尚未可知。本實(shí)驗(yàn)采用神經(jīng)行為學(xué)評分、TTC染色、EB染色、免疫印跡和反轉(zhuǎn)錄PCR等方法,觀察高脂血癥腦缺血再灌注損傷中p38MAPK和MMP-9表達(dá)變化,檢測p38MAPK抑制劑SB203580對p38MAPK和MMP-9表達(dá)的影響,探究高脂血癥腦缺血再灌注損傷中p38MAPK是否可影響MMP-9表達(dá),為明確高脂血癥加重腦缺血再灌注損傷機(jī)制提供新依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、儀器

膽固醇、豬膽鹽(北京奧博星);TTC粉劑(1g索萊寶分裝amresco);甲酰胺(索萊寶分裝amresco),EB伊文思藍(lán)(索萊寶分裝Sigma);p38MAPK一抗和MMP-9一抗(Bioworld);哺乳動(dòng)物組織總蛋白提取試劑、HRP-羊抗兔、ECL超敏感發(fā)光劑(武漢博士德);TRIzol(北京天根生化);PCR引物(上海生工);PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit和Premix Taq TM Hot Start Version(TaKaRa);高速冷凍離心機(jī)(GL-20G-Ⅱ 上海);微孔板分光光度計(jì)(BioTek 美國);電泳儀、濕性轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器);凝膠成像與分析系統(tǒng)(JD-801江蘇捷達(dá))。

1.2 動(dòng)物分組

山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的清潔級雄性SD大鼠,質(zhì)量180g±20g。喂食高脂飼料,高脂血癥動(dòng)物模型成功后,36只高脂血癥大鼠隨機(jī)分為4組,抑制劑SB203580預(yù)處理的腦缺血2h再灌注24h組(SB組),DMSO預(yù)處理的腦缺血2h再灌注24h組(DMSO組),SB203580預(yù)處理的假手術(shù)組(sham+SB組)及DMSO預(yù)處理的假手術(shù)組(sham+DMSO組),每組9只。3只用于TTC染色檢測梗死灶體積,3只用于EB染色檢測血腦屏障通透性,3只用免疫印跡和RT-PCR檢測p38MAPK、MMP-9表達(dá)量及MMP-9 mRNA水平。造模前30min,按5mg/kg(5mg SB203580溶于1ml DMSO中)劑量腹腔注射SB203580[8];DMSO按1ml/kg劑量腹腔注射。

1.3 模型建立

豬油10%、膽固醇3%、蛋黃粉2.5%、豬膽鹽0.5%、基礎(chǔ)飼料84%配制高脂飼料[9]。大鼠在同一環(huán)境下自由進(jìn)食飲水,6周后檢測血脂。高脂血癥模型建立成功后,參照Zea-Longa[10]線栓法,采用直徑0.26mm的天絲太極魚線,頭端蘸蠟使其變得圓鈍,直徑約0.28mm,從左側(cè)頸總動(dòng)脈插入,經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈到達(dá)大腦中動(dòng)脈,遇到阻力即停,插入長度18～20mm。2h后將魚線退出約10mm,恢復(fù)血液供應(yīng),再灌注24h,建立局灶性腦缺血再灌注模型。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)評分

參照Zea-Longa 5分制法[10]對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。0分： 正常,無神經(jīng)損傷癥狀;1分： 右側(cè)前爪部分屈曲或全部屈曲;2分： 行走時(shí)向右側(cè)偏癱轉(zhuǎn)圈;3分： 行走時(shí)向右側(cè)傾倒;4分： 不能自發(fā)行走,意識喪失。將0分及4分的動(dòng)物模型剔除。

1.5 TTC染色檢測梗死灶體積

稱取2 g TTC粉劑溶于100ml 1×PBS(pH 7.2～7.4)溶液中,配成2%工作液。再灌注24h時(shí)將大鼠深麻后迅速斷頭取腦,放于培養(yǎng)皿中-20℃凍存15min,取出后去除嗅球、小腦及腦干,從前向后做2mm厚連續(xù)冠狀切片,放于6孔培養(yǎng)板中,加入適量2% TTC染液,包裹錫紙避光,放入37℃孵箱中作用30min,每隔5min晃動(dòng)培養(yǎng)板1次,使其染色充分。染色結(jié)束后移液器吸出染液,然后加入10%多聚甲醛固定液固定24h[11]。拍照,病理圖像處理系統(tǒng)分析。

1.6 伊文思藍(lán)(Evans blue, EB)染色檢測血腦屏障通透性

再灌注結(jié)束前2h股靜脈注射2% EB染液0.3ml/100g[12],2h后將大鼠深麻迅速斷頭取腦,分離左側(cè)大腦半球稱濕重后放入3ml甲酰胺溶液中,將其放于60℃ 恒溫水浴鍋中24h。5000r/min離心20min取上清液,然后10000r/min再次離心10min取上清液。波長632nm檢測上清液吸光度,據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣本的伊文思藍(lán)濃度,進(jìn)而求出樣本伊文思藍(lán)的含量,用伊文思藍(lán)含量與左側(cè)大腦半球濕重的比值表示血腦屏障通透性。

1.7 免疫印跡檢測p38MAPK和MMP-9表達(dá)水平

提取組織總蛋白,BCA微孔板法測定組織提取液蛋白濃度。垂直凝膠電泳60V恒壓沉積,120V恒壓分離蛋白,80V恒壓轉(zhuǎn)膜80min,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后1×TBST洗膜3次,每次10min。p38MAPK條帶用5%脫脂奶粉封閉2h,加1∶800比例稀釋的兔抗鼠p38一抗,4℃過夜。MMP-9條帶用8%脫脂奶粉封閉2.5h,加1∶4000比例稀釋的兔抗鼠MMP-9一抗,4℃過夜。1∶4000稀釋的羊抗兔二抗室溫作用30min后37℃反應(yīng)1h,ECL超敏感發(fā)光劑暗室曝光顯示蛋白條帶。凝膠成像與分析系統(tǒng)采集圖像并檢測蛋白條帶灰度值。

1.8 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測MMP-9 mRNA

取適量缺血側(cè)大腦皮質(zhì),逐步加入TRIzol、氯仿、異丙醇提取RNA,用RNase-free ddH2O配制的75%乙醇洗滌RNA白色沉淀物兩次,放置2～3min后加入50μl RNase-free ddH2O溶解,酶標(biāo)儀檢測RNA溶液濃度。按TaKaRa公司的PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒操作,獲得cDNA溶液。內(nèi)參β-actin引物,Forward： 5′-CACCCGCGAGTACA ACCTTC-3′; Reverse： 5′-CCCATACCCACCATCA CACC-3′。MMP-9引物,Forward： 5′-AACTCGGCA GGAGAGATGTG-3′;Reverse： 5′-GGTCAGGTTTA GAGCCACGA-3′。配制PCR反應(yīng)液50μl混勻后,94℃預(yù)變性1min,94℃變性30s,60.5℃退火30s,72℃延伸30s,如此變性、退火、延伸循環(huán)30次后,72℃延伸10min,4℃保持。MMP-9 cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物長度為331bp,內(nèi)參cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物長度為207bp,擴(kuò)增產(chǎn)物-80℃保存。取適量擴(kuò)增產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混勻后,瓊脂糖凝膠電泳90V恒壓跑膠,捷達(dá)凝膠圖像采集分析系統(tǒng)處理。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為改變

Sham+DMSO組大鼠和sham+SB組大鼠均未見異常表現(xiàn),神經(jīng)行為學(xué)評分為0分。DMSO組大鼠和SB組大鼠均表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)行為損傷癥狀。DMSO組大鼠主要表現(xiàn)為向右側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈,神經(jīng)行為學(xué)評分為2.87±0.39分。SB組大鼠大部分表現(xiàn)為右側(cè)前爪部分屈曲,小部分表現(xiàn)為向右側(cè)轉(zhuǎn)圈,神經(jīng)行為學(xué)評分為1.59±0.26分。與DMSO組比較,SB組評分明顯降低(P<0.05)。

2.2 各組腦梗死灶體積

腦組織冠狀切片TTC染色后,正常組織呈現(xiàn)紅色,而缺血梗死區(qū)為白色。兩假手術(shù)組腦組織均勻紅染,未見梗死區(qū),而SB組和DMSO組均可見不同范圍的白色梗死灶,與相應(yīng)假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DMSO組大鼠腦梗死灶體積百分比為32.09±0.35,而SB組大鼠腦梗死灶體積百分比為14.37±0.31,與DMSO組比較明顯減小(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組腦梗死灶體積

2.3 各組大鼠血腦屏障通透性水平

兩假手術(shù)組EB含量均較低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與sham+DMSO組比較,DMSO組EB含量顯著升高(P<0.05)。與DMSO組比較,SB組EB含量明顯降低(P<0.05)(表1)。

2.4 p38MAPK和MMP-9表達(dá)水平

兩假手術(shù)組均可見少量p38MAPK和MMP-9表達(dá),而DMSO組和SB組p38MAPK和MMP-9表達(dá)均明顯升高。兩假手術(shù)組間比較,p38MAPK和MMP-9表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CP>0.05)。與sham+DMSO組比較,DMSO組p38MAPK和MMP-9表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)。與DMSO組比較,SB組p38MAPK和MMP-9表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)(圖2,表1)。

圖2 各組p38MAPK和MMP-9相對表達(dá)水平

GroupEB content (μg/g)p38MAPK (OD)MMP-9 (OD)Sham+DMSO0.50±0.030.24±0.010.03±0.003Sham+SB0.48±0.060.23±0.010.029±0.002DMSO7.87±0.34*0.76±0.012*0.28±0.008*SB2.44±0.16△#0.48±0.010△#0.15±0.009△#

*P<0.05vssham+DMSO;△P<0.05vssham+SB;#P<0.05vsDMSO

2.5 各組MMP-9 mRNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物水平

兩假手術(shù)組均有少量MMP-9 mRNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DMSO組和SB組MMP-9 mRNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物增多,與sham+DMSO組比較,DMSO組MMP-9 mRNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物顯著升高(P<0.05)。與DMSO組比較,SB組MMP-9 mRNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物則明顯減少(P<0.05)(圖3)。

3 討論

3.1 p38MAPK和MMP-9參與腦缺血再灌注損傷

腦缺血再灌注損傷過程中誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)增加和活化后,降解毛細(xì)血管基底膜的膠原、層黏連蛋白和內(nèi)皮緊密連接的閉鎖小帶,導(dǎo)致血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞,通透性增高,引起血管源性水腫和誘發(fā)炎癥因子進(jìn)入腦組織,損害神經(jīng)細(xì)胞[4,13]。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶通路中的關(guān)鍵蛋白之一,腦缺血再灌注損傷中p38MAPK激活后主要表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[14-15],抑制p38MAPK激活可以減輕細(xì)胞凋亡,其通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)而發(fā)揮作用[1]。此外,有研究[16]顯示p38MAKP通路激活后可通過影響iNOS而調(diào)節(jié)NO含量,NO是調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)的一種重要因子[17],在腦缺血再灌注發(fā)生時(shí)iNOS誘導(dǎo)催化的NO,可以通過影響鳥苷酸環(huán)化酶及cGMP的水平對MMP-9進(jìn)行調(diào)節(jié)[18]。腦缺血再灌注損傷過程中NF-κB表達(dá)升高,并通過激活下游炎癥因子如MMP-9等加重腦損傷,而表達(dá)增高活化的p38MAPK可與NF-κB通路下游聚合,放大炎癥反應(yīng),進(jìn)一步增加MMP-9的表達(dá)[19]。

圖3 各組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)MMP-9 mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平

3.2 SB203580降低p38MAPK和MMP-9的表達(dá)而減輕高脂血癥腦缺血再灌注損傷

本課題組前期研究結(jié)果[6-7]顯示p38MAPK和MMP-9表達(dá)增高參與高血脂加重腦缺血再灌注損傷,且兩者均在再灌注24h時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰,但未明確在該病理生理過程中p38MAPK是否可調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá),本實(shí)驗(yàn)檢測高脂血癥腦缺血再灌注損傷中p38MAPK和MMP-9的表達(dá)量,觀察抑制劑SB203580對p38MAPK和MMP-9表達(dá)的影響,并結(jié)合神經(jīng)行為學(xué)評分、TTC染色和EB染色綜合研究。

免疫蛋白印跡結(jié)果顯示： 兩假手術(shù)組腦組織中僅有少量p38MAPK和MMP-9表達(dá),在腦缺血再灌注損傷后,p38MAPK和MMP-9表達(dá)均明顯升高。而使用p38MAPK特異性抑制劑SB203580后,不僅p38MAPK表達(dá)降低,且MMP-9表達(dá)亦明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示,使用SB203580后MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較使用溶劑DMSO明顯降低。在損傷過程中減少p38MAPK表達(dá)即可引起MMP-9表達(dá)降低,且影響MMP-9表達(dá)的轉(zhuǎn)錄過程,此與余音等[8]研究結(jié)果一致。

伊文思藍(lán)與血漿白蛋白有高度親和力,在血液內(nèi)與血漿白蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。正常狀態(tài)下血漿白蛋白不能通過血腦屏障進(jìn)入腦組織,當(dāng)腦組織損傷血腦屏障破壞,其通透性增高,伊文思藍(lán)血漿白蛋白結(jié)合形成的復(fù)合物即可通過血腦屏障進(jìn)入腦組織染色。通過檢測腦組織伊文思藍(lán)含量可間接了解血腦屏障的完整性、通透性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,兩假手術(shù)組僅有微量伊文思藍(lán),這可能是生理鹽水灌注不完全,血管內(nèi)殘留的EB。而DMSO組和SB組腦組織EB含量顯著增高,提示腦缺血再灌注損傷中血腦屏障破壞,其通透性增高。但SB組EB含量較DMSO組明顯降低,說明高脂血癥腦缺血再灌注損傷中p38MAPK特異性抑制劑SB203580可降低血腦屏障通透性。這與SB203580抑制p38MAPK表達(dá),進(jìn)而降低MMP-9表達(dá),減輕對血腦屏障的破壞有關(guān)。

TTC染色檢測梗死灶體積,結(jié)果顯示,使用抑制劑SB203580后梗死灶體積較使用溶劑DMSO明顯縮小。神經(jīng)行為學(xué)評分顯示,抑制劑SB203580可明顯改善神經(jīng)行為損傷癥狀,評分降低。這可能是因SB203580抑制p38MAPK的表達(dá),進(jìn)而引起MMP-9表達(dá)降低,與p38MAPK和MMP-9表達(dá)降低減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生,減輕炎癥反應(yīng)等有關(guān)。但高脂血癥腦缺血再灌注損傷過程中,p38MAPK究竟通過何途徑上調(diào)MMP-9表達(dá)尚不清楚,有待進(jìn)一步探究。