張集祥 孔 雪 王 軍 王政富 陳 芳 趙海全 劉為民

(佛山科學技術(shù)學院, 佛山 528231)

長期以來,小腦被認為是調(diào)節(jié)運動功能的腦結(jié)構(gòu),但在過去的10年中,小腦的認知功能已經(jīng)逐漸為人們確認,特別是其在導航中的功能已為實驗所證實[1-4]。例如,利用轉(zhuǎn)基因小鼠LT-PKC1,研究者表明小腦皮層出現(xiàn)的長時程突觸后抑制(LTD)在基于海馬內(nèi)地圖而進行的路徑優(yōu)化上具有重要作用,小腦缺乏平行纖維對浦肯野細胞樹突的LTD時,將會嚴重影響海馬位置細胞的發(fā)放[1,4]。許多研究都表明小腦對于海馬發(fā)揮其空間認知和空間記憶功能產(chǎn)生重要影響。但是,小腦對海馬的支配途徑卻一直不太明確,在哺乳動物僅見Heath等[5]1974年在成年恒猴和貓所做的研究,表明存在小腦頂核向海馬CA2、CA3、齒狀回、杏仁核的基外側(cè)核以及下托的直接投射,但是有關(guān)小腦皮質(zhì)是否有向海馬結(jié)構(gòu)的直接投射仍未見報道。副高紋狀體為海馬結(jié)構(gòu)外側(cè)的腦結(jié)構(gòu),在端腦背側(cè)形成明顯的背側(cè)矢狀隆起。Watenabe等[6]認為鳥類的副高紋狀體主要處理物體在哪里的信息,其內(nèi)腦皮(entopallium)負責處理物體的形狀、顏色、質(zhì)感等物體本身的信息;Wild等[7]證實鴿子副高紋狀體嘴側(cè)端發(fā)出纖維到達小腦皮質(zhì),終止于小腦皮質(zhì)的三個層里,屬于非攀緣-非苔蘚纖維,表明禽類的副高紋狀體與小腦在功能上和形態(tài)上有密切聯(lián)系。本實驗室前期的工作表明,在青年雞存在小腦皮質(zhì)的浦肯野細胞向海馬的直接投射[8],本研究進一步利用電損毀-透射電鏡觀察了成年雞小腦向海馬和副高紋狀體的直接投射。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

4月齡粵禽黃雞20只,雌雄不拘,體重約1.8kg,購自佛山南海種雞場。

1.2 主要試劑

多聚甲醛購自天津百世化工有限公司;戊二醛購自天津大茂化學試劑廠;鋨酸由中山大學醫(yī)學院電鏡室提供;水合氯醛(分析純)購自天津科密歐化學試劑有限公司;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP, RZ=3, SigmaⅣ型)、硝普鈉(亞硝基鐵氰化鈉, Sodium nitroferricyanide)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺,TMB)、二甲胂酸鈉均購自Sigma-Aldrich公司。

1.3 主要儀器

江灣Ⅰ型C小動物腦立體定位儀,上海奧爾科特生物科技有限公司;KD-500型推拉式三用切片機,KD-Ⅳ電腦快速制冷器,浙江科迪儀器設(shè)備有限公司;1μl微量進樣器,上海光正醫(yī)療儀器有限公司;Tiger顯微圖像分析系統(tǒng),暨南大學組織學與胚胎學教研室;LKB-V型超薄切片機,Leika公司;Philips CM-10型透射電鏡,荷蘭Philips公司。

1.4 HRP逆行追蹤

按3ml/kg經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛溶液進行全麻,將動物固定于江灣Ⅰ型C小動物腦立體定位儀,開顱,將已吸取40%HRP水溶液的玻璃微針(內(nèi)徑20～40μm)固定于立體定位儀的電極夾持器上,在正中矢狀面(以矢狀竇判定)稍偏左側(cè)的部位向端腦海馬進針,注射量0.6μl,留針15min,縫合創(chuàng)口。術(shù)后存活3d,按Mesulam[9]方法灌注固定,取端腦兩半球、小腦和腦干,翌日制冰凍連續(xù)切片。切片經(jīng)TMB成色,自然干燥后中性紅復染,脫水、透明、中性樹脂封片后顯微鏡觀察,攝影。

1.5 電凝損毀小腦術(shù)

按3ml/kg經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛溶液進行全麻,將動物固定于江灣Ⅰ型C小動物腦立體定位儀,外科方法開顱,于電極夾持器固定一自制的損毀電極(單電極),電極尖端暴露1～1.5mm,按預(yù)先確定位置向小腦Ⅵ葉表層進針約2.5mm(硬膜下),然后接通直流電正極,負極接于動物肛門上,通以5mA的直流電4min。術(shù)后縫合傷口,密切觀察護理。

1.6 透射電鏡觀察

動物存活7d,重新深度麻醉,綁縛固定,開胸,經(jīng)升主動脈灌注0.7%禽生理鹽水400ml,然后灌注用0.1mol/L二甲胂酸鈉-鹽酸緩沖溶液(pH7.4)溶解的含3%多聚甲醛、1.25%戊二醛的固定液500ml。注畢取腦,投入2.5%戊二醛溶液中4℃過夜,翌日取小腦作冷凍連續(xù)切片,甲苯胺藍染色,上行乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,觀察損毀準確性。對于損毀部位準確的個體,選左側(cè)海馬結(jié)構(gòu)的海馬(Hp)、旁海馬內(nèi)側(cè)區(qū)(APHm)和副高紋狀體(HA)的前后部及端腦谷(Va)部位取電鏡材料(圖1),2.5%戊二醛后固定4h,PBS漂洗,鋨酸固定2h,上行梯度丙酮脫水,Epon 812浸透包埋,作半薄切片(厚1μm),以進行光鏡定位,然后制作超薄切片,常規(guī)電鏡染色,于Philips CM-10型透射電鏡下觀察照相。

圖1 端腦電鏡觀察的取材部位,★示端腦的取材部位。A： 距“0”點向前6.8mm;B： 距“0”點向前8.6mm。Hp： 海馬;APHm： 旁海馬內(nèi)側(cè)區(qū);APHi： 旁海馬中間區(qū);APHim： 旁海馬中間區(qū)內(nèi)側(cè)部;APHil： 旁海馬中間區(qū)外側(cè)部;APHI： 旁海馬外側(cè)區(qū);HA： 副高紋狀體;HD： 背高紋狀體;Va： 端腦谷;IHA： 間副高紋狀體;HV： 腹高紋狀體.

Fig 1 The sites of sampling in the telencephalon for electron microscope observation, ★ showed the sites of sampling in the telencephalon. A： At the level of 6.8mm anterior to the zero point; B： At the level of 8.6mm anterior to the zero point. Hp： Hippocampus; APHm： Medial subdivision of parahippocampus; APHi： Intermediate subdivision of parahippocampus; APHim： Medial part of the intermediate subdivision of parahippocampus; APHil： Lateral part of the intermediate subdivision of parahippocampus; APHI： Lateral subdivision of parahippocampus; HA： Hyperstriatum accessorium; HD： Hyperstriatum dorsale; Va： Vallecula telencephali; IHA： Intermedium hyperstriatum accessorium; HV： Hyperstriatum ventrale.

2 結(jié)果

2.1 HRP追蹤小腦內(nèi)標記細胞

雞小腦內(nèi)第Ⅰ～Ⅹ葉皮質(zhì)中的浦肯野細胞層均可見被逆行標記的浦肯野細胞(圖2),其中Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ葉的標記細胞最多,標記細胞以對側(cè)較多,細胞內(nèi)標記顆粒疏淡,但清晰可見。

2.2 電凝損毀部位

與哺乳類小腦一樣,禽類的小腦皮層也分為3層,包括分子層(molecular layer, ML)、浦肯野細胞層(Purkinje cell layer, PCL)和顆粒層(granular layer, GL)[10]。本實驗采用5mA正電極刺入小腦Ⅵ葉內(nèi),電凝4min,產(chǎn)生損毀(圖3A、C),此點位于Ⅵ葉皮質(zhì)部位,可見其內(nèi)浦肯野細胞層和顆粒層細胞均受到損毀,大量浦肯野細胞和顆粒細胞消失成為空白區(qū),部分分子層內(nèi)無明顯細胞結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)模糊,電損毀位置和效果均較為理想。

2.3 海馬結(jié)構(gòu)的潰變終末與潰變纖維

采取電凝損毀小腦Ⅵ葉后,在海馬結(jié)構(gòu)的Hp、APHm部位和副高紋狀體的前后部位及腦谷部位均可觀察到潰變的終末,在Hp、APHm內(nèi)可觀察到極少量的潰變纖維。

潰變纖維為細的薄髓纖維,電鏡下見髓鞘分層解散,軸漿皺縮,部分軸索內(nèi)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常的膜性結(jié)構(gòu)(圖4G)。

圖2 HRP注射位點及小腦標記細胞。A： 海馬結(jié)構(gòu)的HRP注射點,低倍鏡,×26.8,白色箭頭示注射點;B： 小腦Ⅵ葉皮質(zhì)中被標記的浦肯野細胞,低倍鏡,×66;C： 為B圖矩形框的放大,高倍鏡(油鏡)下標記的浦肯野細胞,×680;↑示標記的浦肯野細胞;VL： 側(cè)腦室;Hp： 海馬;APHm： 旁海馬內(nèi)側(cè)區(qū);APHim： 旁海馬中間區(qū)內(nèi)側(cè)部.

圖3 小腦Ⅵ葉皮質(zhì)電損毀部位。A： 小腦損毀部位,矢狀切面,低倍放大,↑表示損毀位置,冰凍切片,未經(jīng)染色;B： 為A經(jīng)甲苯胺藍染色,↑表示損毀位置;C： 為B圖中矩形框部的局部放大圖,高倍放大(×132),↑示損毀的浦肯野細胞層,★示顆粒細胞消失形成的空白區(qū),◆示結(jié)構(gòu)模糊的分子層;ML： 分子層;PCL： 浦肯野氏細胞層;GL： 顆粒層.

Fig 2 The injection site of the horseradish peroxidase and the labeled cells in the cerebellum. A： Lower magnification (×26.8) of the site of the horseradish peroxidase injection in the hippocampal formation, the white arrowhead showed the injection site; B： Lower magnification (×66) of the labeled Purkinje cells in the cerebellar cortex of the folium Ⅵ in the cerebellum. C： The higher magnification (oil immersion objective, ×680) of the labeled Purkinje cells in the enlargement of the rectangle in B. ↑showed the labeled Purkinje cells; VL： Lateral ventrical; Hp： Hippocampus; APHm： Medial subdivision of parahippocampus; APHim： Medial part of the intermediate subdivision of parahippocampus.

Fig 3 Site of electric destroying in the cerebellar cortex of the folium Ⅵ. A： Lower magnification of the destroyed site in the cerebellum, sagittal section; ↑ indicating the destroyed site. B： Lower enlargement of the same section in A, stained with toluidine blue, ↑ indicating the destroyed site. C： Higher enlargement (×132) of the rectangule in B, ↑ showed the destroyed Purkinje cells, ★ showed the destroyed area in the granular cell layer, ◆ showed the irregular structure in the molecular layer near the destroyed site. ML： Molecular layer; PCL： Purkinje cell layer; GL： Granular layer.

圖4 端腦各部位的潰變相。T: 潰變的軸突終末;F: 潰變的神經(jīng)纖維;NB: 正常神經(jīng)元胞體;N: 正常的神經(jīng)元細胞核;↑示聚集的囊泡; 白色箭頭示變性的髓鞘。A: Hp內(nèi)的變性軸突終末;B～E: APHm內(nèi)的變性軸突終末;F: 前部副高紋狀體內(nèi)的變性終末;G: Hp內(nèi)的一個小型變性纖維.Fig 4The degenerating views in some parts of the telencephalon. T: Degen-erated axon terminals; F: Degenerated nerve fiber; NB: Normal cell body of neuron; N: Nucleus of normal neurons;↑showed the the “foam-like” aggregated vesicles in the degenerating boutons; white ar-rowhead showed the unwinded myclin sheath in degenerated small fi-bers. A: degenerated terminals in the Hp of the hippocampus forma-tion; B-E: Degenerated terminals in the APHm of the hippocampus formation; F: The degenerated terminals in the anterior part of the hyperstriatum accessorium; G: A small degenerated fiber in the Hp.

潰變終末常見出現(xiàn)于結(jié)構(gòu)正常的神經(jīng)元胞體旁,常見的潰變相有： (1) 終末內(nèi)囊泡聚集,形成所謂“泡沫型”變性,大部分變性終末內(nèi)囊泡為圓形清亮小泡,無核心,聚集的囊泡團周圍有明顯的空白區(qū);線粒體結(jié)構(gòu)模糊;部分變性終末可見與神經(jīng)元胞體形成軸-體突觸(圖4A、D、F);(2) 水腫型變性,終末內(nèi)出現(xiàn)大片低電子密度的空白區(qū),部分高電子密度結(jié)構(gòu)聚集,線粒體孤立而明顯,其周邊電子密度低(圖4C);(3) 異常膜結(jié)構(gòu)型,在終末內(nèi)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常的的變性膜結(jié)構(gòu)(圖4E)。

2.3.1 海馬結(jié)構(gòu)的Hp和APHm內(nèi)的潰變結(jié)構(gòu) Hp內(nèi)可見較多的潰變終末,潰變終末內(nèi)囊泡為圓形清亮小泡,聚集,聚集團外圍是大片的電子空白區(qū),可見潰變終末與神經(jīng)元胞體形成軸-體突觸(圖4A),并可觀察到少量的潰變纖維(圖4F);APHm內(nèi)也可觀察到多量潰變終末,且其變性終末多見于與樹突形成的軸樹突觸(圖4B、C),少量突觸為軸體突觸(4D)。

2.3.2 副高紋狀體前、后部內(nèi)的潰變情況 HA前部內(nèi)只見少量的潰變終末(圖4F),且潰變不明顯,未見潰變纖維;HA后部較前部位潰變終末多,且潰變程度顯著,但未觀察到潰變纖維。

2.3.3 端腦谷 幾乎見不到典型的潰變終末,偶見終末內(nèi)囊泡聚集,但囊泡團周圍空白區(qū)少而狹窄。不明顯。

3 討論

本實驗采用電凝損毀小腦Ⅵ葉皮質(zhì)部位,探討小腦向端腦的海馬結(jié)構(gòu)、副高紋狀體和端腦谷部位的直接投射。在損毀對側(cè)的海馬結(jié)構(gòu)的Hp、APHm部位內(nèi)均可觀察到多量的潰變終末和少量潰變纖維,但APHm部位觀察到的潰變終末和纖維不如Hp部位觀察到的多;在副高紋狀體的前后部位只可觀察到少量潰變終末,這說明小腦向端腦的直接投射主要投射到海馬結(jié)構(gòu),且大部分集中在海馬結(jié)構(gòu)的Hp。王政富等[11]曾采用紅藻氨酸選擇性損毀青年雞小腦Ⅵ葉浦肯野細胞,在海馬結(jié)構(gòu)APHm內(nèi)觀察到潰變終末。筆者在成年雞中卻觀察到這一位置出現(xiàn)的變性終末和纖維較少,可能是因為禽類在成長發(fā)育過程中,其小腦向海馬結(jié)構(gòu)的直接投射逐漸減少造成的。在動物的幼年時期,中樞神經(jīng)系統(tǒng)尚未完善,存在不同來源神經(jīng)投射的相互競爭[12],朱寧等[13]研究表明海馬結(jié)構(gòu)的神經(jīng)聯(lián)系在發(fā)育過程中不斷地清除出生后大量的異常的神經(jīng)聯(lián)系,從而達到神經(jīng)系統(tǒng)的高效性,避免冗余和錯誤建設(shè)。

關(guān)于脊椎動物小腦向海馬結(jié)構(gòu)進行信息輸送的研究是目前小腦功能研究的熱點問題,涉及到小腦乃至前庭感覺系統(tǒng)參與動物空間認知和空間記憶的形成[14]。在哺乳動物,小腦匯集了軀體本體的和外感的大量信息,小腦整合后信息的輸出經(jīng)浦肯野細胞到達頂核、齒狀核和間置核(栓狀核和球狀核),換元中繼后到達丘腦的腹外側(cè)核后部和腹后外側(cè)核,由后兩者再中繼發(fā)出到大腦新皮質(zhì)的體軀感覺區(qū),形成個體對所處環(huán)境的空間認知以及個體本身姿勢的知覺[3]。海馬結(jié)構(gòu)是近20年發(fā)現(xiàn)的另一個重要的空間認知和空間記憶的腦結(jié)構(gòu),其內(nèi)存在大量的位置細胞、網(wǎng)格細胞、邊緣細胞、頭部朝向細胞,發(fā)揮著空間認知、空間記憶、空間導航的作用,然而這類神經(jīng)元是如何獲得自體和客體的空間信息,一直沒有明確的答案。禽類的海馬結(jié)構(gòu)具有類似于哺乳動物海馬結(jié)構(gòu)的功能和形態(tài)。本實驗結(jié)果再次印證了筆者前期的觀察,即在雞存在著小腦向海馬結(jié)構(gòu)的直接投射。本實驗也進一步證明,在成年雞同樣具有直接的小腦向海馬結(jié)構(gòu)的投射,并且這種投射包括了副高紋狀體。