趙瑞 姚黎清

[摘要] 目的 觀察人類ApoE3基因過表達(dá)對大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12凋亡的影響。 方法 將PC12轉(zhuǎn)染含人ApoE3基因的pEGFP質(zhì)粒及空載體pEGFP質(zhì)粒，經(jīng)持續(xù)篩選建立起穩(wěn)定表達(dá)人ApoE3基因和質(zhì)粒pEGFP的PC12的細(xì)胞系。將細(xì)胞分成4組：正常對照組（用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)）、H2O2組（用400 μmol/L H2O2誘導(dǎo)4 h）、H2O2+空質(zhì)粒組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP經(jīng)篩選后用H2O2誘導(dǎo)4 h）、H2O2+ApoE3組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染ApoE3經(jīng)篩選后用H2O2誘導(dǎo)4 h）。通過CCK-8檢測細(xì)胞存活率，Hochest33258檢測細(xì)胞凋亡。 結(jié)果 與正常對照組比較，H2O2組、H2O2+空質(zhì)粒組和H2O2+ApoE3組細(xì)胞存活率下降（P < 0.05），細(xì)胞凋亡增加。H2O2組和H2O2+空質(zhì)粒組各指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；H2O2+ApoE3組細(xì)胞存活率明顯高于H2O2組、H2O2+空質(zhì)粒組（P < 0.05），H2O2組+ApoE3組細(xì)胞凋亡較H2O2組和H2O2+空質(zhì)粒組明顯減少。 結(jié)論 ApoE3基因高表達(dá)對H2O2所致的PC12細(xì)胞氧化損傷有很好的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] PC12細(xì)胞；載脂蛋白E3基因；過氧化氫；凋亡

[中圖分類號] R744 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（b）-0004-04

[Abstract] Objective To observe the effect of human ApoE3 gene high expression on the apoptosis of rat adrenal pheochromocytoma PC12 cells. Methods The pEGFP plasmid containing human ApoE3 gene and pEGFP plasmid were transfected with PC12 cells， and PC12 cell line was established that could stably express human ApoE3 gene and pEGFP plasmid through continuous screening. PC12 cells were allocated into 4 groups： normal control group， H2O2 group （cultured with 400 μmol/L H2O2 for 4 hours）， liposome group （pEGFP transfection and H2O2 culture） and ApoE3 group （ApoE3 transfection and H2O2 culture）. Cell survival was tested by CCK-8 method， cell apoptosis was detected by Hochest33258. Results Compared with the normal control group， cell survival rate was decreased in the other three groups （P < 0.05）， while cell apoptotic was increased. The differences in the indexes mentioned above were not significant between H2O2 group and liposome group（P > 0.05）. The cell survival rate was higher in the ApoE3 group， compared with H2O2 group and H2O2+liposome group （P < 0.05）； the apoptosis was obviously lower in the ApoE3 group， compared with the H2O2 group and H2O2+liposome group. Conclusion The overexpression of ApoE3 gene has a great protective effect on the oxidative damage of PC12 cell mediated by H2O2.

[Key words] PC12 cells； Apolipoprotein E3 gene； Hydrogen Peroxide； Apoptosis

脊髓損傷是一類致殘率和致死率均較高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由于此類疾病治療困難，術(shù)后康復(fù)時(shí)間長，多預(yù)后不良，給患者家庭以及社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。急性期脊髓二次損傷的發(fā)生與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量聚集密切相關(guān)，氧化應(yīng)激成為脊髓損傷的一個(gè)特點(diǎn)，大量ROS通過氧化細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜損害細(xì)胞。載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的載脂蛋白，參與了神經(jīng)元脂質(zhì)的代謝、鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)、信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)等，與腦外傷、腦出血性疾病和脊髓損傷患者的預(yù)后都有密切的關(guān)系。人類ApoE存在ApoE2、ApoE3、ApoE4三種亞型，在疾病的發(fā)生和預(yù)后等方面，不同亞型的攜帶者表現(xiàn)出不同的效應(yīng)，其中ApoE2、ApoE3能促進(jìn)脊髓損傷患者功能恢復(fù)，ApoE4對脊髓損傷患者功能恢復(fù)有不良影響[1]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ApoE參與了脊髓損傷后氧化應(yīng)激的過程[2]。本實(shí)驗(yàn)擬用H2O2刺激PC12細(xì)胞建立氧化損傷模型，用以研究脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及來源

PC12細(xì)胞購自中科院昆明動(dòng)物所；脂質(zhì)體2000（Lipofectamine 2000）購自Invitrogen公司產(chǎn)品；遺傳霉素（G418）為Sigma產(chǎn)品；過氧化氫（H2O2）為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品；高糖培養(yǎng)基（DMEM）為Hyclone公司產(chǎn)品；胰蛋白酶購自GIBICO公司；胎牛血清為BI公司產(chǎn)品；DMSO購于上海生物工程有限公司；CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒試劑為日本同仁公司產(chǎn)品；Hochest33258試劑為凱基公司產(chǎn)品；攜帶人ApoE3基因的質(zhì)粒（pEGFP-N1-H-ApoE3）上海吉滿公司構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方式培養(yǎng)，將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。消化傳代使用含有EDTA的0.25%胰酶，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染及細(xì)胞篩選

1.2.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，以1×105/mL密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，取2 μg質(zhì)粒加入到200 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中輕輕搖勻后在室溫下放置5 min；取10 μL脂質(zhì)體加入到200 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中輕輕搖勻后再在室溫下放置5 min；然后混合稀釋的脂質(zhì)體和質(zhì)粒輕輕搖勻，室溫孵育30 min，最后將混合液輕輕加入到待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，4～6 h后換液。

1.2.2.2 細(xì)胞篩選 ①最佳G418篩選濃度確定：設(shè)置不同的G418梯度濃度連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2周，以細(xì)胞完全死亡的最低G418濃度為篩選濃度，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳G418篩選濃度為1000 μg/mL；②將轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞用1000 μg/mL G418連續(xù)篩選培養(yǎng)2周，每2天換液1次，直到單性克隆細(xì)胞株出現(xiàn)；挑選單克隆細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

①正常對照組（正常細(xì)胞培養(yǎng)）；②H2O2組；③H2O2+空質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1+H2O2）；④H2O2+ApoE3組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-H-ApoE3+H2O2）。

1.2.4 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型的建立

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)密度為4×104個(gè)/mL鋪于96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，分別采用0、200、400、600、800 μmol/L的 H2O2進(jìn)行干預(yù)，每孔設(shè)5個(gè)復(fù)孔，損傷4 h后用CCK-8檢測細(xì)胞活性以確定最佳損傷濃度。

1.2.5 ApoE3對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用檢測

正常對照組加入100 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基；模型組400 μmol/L H2O2作用4 h；空質(zhì)粒組400 μmol/L H2O2作用4 h；ApoE3組400 μmol/L H2O2作用4 h，4 h后加入CCK-8避光孵育1～4 h后酶標(biāo)儀檢測OD值；按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組-空白對照組）/（正常對照組-空白對照組）×100%。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染率計(jì)算（Hochest33258 染色法）：正常Hochest33258熒光染色顯示PC12細(xì)胞核圓呈淡藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞的胞核呈強(qiáng)亮白色熒光。實(shí)驗(yàn)時(shí)先使用PBS清洗3遍，用4%的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，PBS清洗3遍然后每孔加入300 μL Hoechst33258染色液，室溫下避光染色5 min，PBS清洗3次，在正置熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ApoE3蛋白在PC12細(xì)胞中的表達(dá)

光學(xué)顯微鏡觀察所示，ApoE3組細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生改變，細(xì)胞呈錐形，遮光性好；熒光顯微鏡下觀察可見ApoE3組細(xì)胞內(nèi)表達(dá)帶有綠色熒光的ApoE3蛋白。光學(xué)顯微鏡下所示，空質(zhì)粒組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)正常；熒光顯微鏡下觀察可見細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)出均勻的綠色熒光蛋白。見圖1（封四）。

2.2 H2O2誘導(dǎo)PC12最佳損傷濃度確定

與0 μmol/L H2O2組比較，200、400、600、800 μmol/L H2O2組細(xì)胞存活率降低，且與H2O2濃度呈線性負(fù)相關(guān)（r = -0.981，P < 0.05），其中400 μmol/L H2O2組細(xì)胞存活率為（48.66±0.07）%，在后續(xù)試驗(yàn)中采用此濃度建立PC12細(xì)胞損傷模型。見表1。

2.3 ApoE3對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

與正常對照組比較，H2O2組、H2O2+空質(zhì)粒組、H2O2+ApoE3組細(xì)胞存活率降低（P < 0.05）。H2O2+空質(zhì)粒組與H2O2組細(xì)胞存活率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與H2O2組、H2O2+空質(zhì)粒組比較，H2O2+ApoE3組細(xì)胞存活率顯著升高（P < 0.05）。見表2。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

Hochest33258熒光染色顯示：正常PC12細(xì)胞核圓呈淡藍(lán)色，細(xì)胞核完整，凋亡細(xì)胞的胞核呈強(qiáng)亮白色熒光，細(xì)胞核固縮，甚至破碎；其中正常對照組細(xì)胞凋亡很少，其他組細(xì)胞凋亡明顯，但H2O2+ApoE3組凋亡細(xì)胞較H2O2組和H2O2+空質(zhì)粒組明顯減少。見圖2（封四）。

3 討論

脊髓損傷的機(jī)制主要包括原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。其中，原發(fā)性損傷是局限的、不可逆的，損傷后數(shù)分鐘到數(shù)天內(nèi)可逐漸形成可干預(yù)的繼發(fā)損害。繼發(fā)性脊髓損傷的病理改變是由微循環(huán)障礙、興奮性氨基酸毒性、自由基損傷、一氧化氮機(jī)制、細(xì)胞調(diào)亡與壞死、鈣超載、炎性反應(yīng)、神經(jīng)肽、內(nèi)皮素、前列腺素等共同作用的結(jié)果。脊髓組織含有豐富的脂類物質(zhì)，易感于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生理狀態(tài)下，內(nèi)源性氧化系統(tǒng)（包括超氧化物歧化酶和過氧化氨酶等）為了維持人體內(nèi)各種細(xì)胞和亞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性，會(huì)有效地消除人體內(nèi)多余的自由基。脊髓損傷后，自由基生成增加、清除障礙，脊髓組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物蓄積，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、流動(dòng)性和通透性遭到破壞，同時(shí)抗氧化劑水平降低、Na+-K+-ATP酶系統(tǒng)受抑制，脊髓組織缺血、缺氧，細(xì)胞能量代謝失常，細(xì)胞內(nèi)鈣超載使細(xì)胞線粒體電子傳遞鏈脫偶聯(lián)，進(jìn)而又產(chǎn)生和釋放大量氧自由基，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞及髓鞘的結(jié)構(gòu)與功能受到損害[3-4]。有研究認(rèn)為ROS可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化作用，并在脊髓損傷過程中發(fā)揮中樞性作用。ROS生成增多或未及時(shí)清理，會(huì)引起細(xì)胞凋亡、壞死或自噬，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元功能喪失[5-6]。ApoE分子量為34 kD，由299個(gè)氨基酸組成，基因位于19號染色體上[7]，在血漿膽固醇和甘油三酯代謝中發(fā)揮重要的作用。研究人員通過離子層析和雙向電泳已成功鑒定出這3種不同的亞型，主要區(qū)別在于112位的半胱氨酸和158位的精氨酸有所差異，其中人體內(nèi)ApoE3的基因頻率最高[8]。近年來有許多研究發(fā)現(xiàn)ApoE在脊髓損傷后表達(dá)量增高[9]，國外有學(xué)者利用外源性ApoE模擬肽治療小鼠脊髓損傷效果明顯[10]，這些研究印證了ApoE具有神經(jīng)保護(hù)作用。ApoE4基因作為阿爾茨海默病的危險(xiǎn)因素早已被人們所熟知[11-13]。有研究發(fā)現(xiàn)ApoE2、ApoE3能夠促進(jìn)神經(jīng)元突起生長，使神經(jīng)元突起數(shù)量增加更快，而ApoE4的作用明顯弱于ApoE2和ApoE3[14]。這種作用是因?yàn)锳poE與線粒體膜上F1-ATPase亞基結(jié)合破壞了線粒體結(jié)構(gòu)[15]，而神經(jīng)元的線粒體主要參與了突觸的發(fā)生功能。

氧化應(yīng)激在繼發(fā)性脊髓損傷中發(fā)揮主導(dǎo)作用，越來越多的研究表明ApoE與氧化應(yīng)激有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道ApoE4可以和神經(jīng)元中的線粒體結(jié)合，這就為人們研究ApoE與氧化應(yīng)激的相關(guān)性提供了一個(gè)重要的靶點(diǎn)，它提示ApoE可能通過作用于線粒體來影響氧化應(yīng)激[15]。研究表明內(nèi)源性ApoE會(huì)降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)程度從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16]。氧化應(yīng)激不僅會(huì)造成細(xì)胞的損傷而且可以通過激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路引起細(xì)胞凋亡，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ApoE可以降低細(xì)胞色素C的釋放，抑制Caspase-3凋亡途徑，從而發(fā)揮保護(hù)中樞神經(jīng)的作用[17]，但是對于ApoE亞型的作用研究不夠明確。因?yàn)橄噍^ApoE2和ApoE4而言，ApoE3是人體內(nèi)存在最多的載脂蛋白，它的作用機(jī)制對于研究ApoE對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建人類ApoE3過表達(dá)載體，并在H2O2作用下觀察其對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。初步發(fā)現(xiàn)ApoE3能夠提高神經(jīng)細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞凋亡。遺憾的是，關(guān)于ApoE3對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)理目前還缺乏系統(tǒng)的研究，ApoE3是通過影響線粒體、ERK通路還是其他作用機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用有待進(jìn)一步的研究。

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