李丹 余濤 李景 張帆 曾俊芬 彭燕

[摘要] 目的 分析可溶性載體SLC19A3基因在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義，并探討蟾毒靈（Bufalin）對乳腺癌細(xì)胞中SLC19A3基因的干預(yù)作用。 方法 檢索Oncomine和GEO數(shù)據(jù)庫中從建庫至今有關(guān)乳腺癌和Bufalin干預(yù)乳腺癌的數(shù)據(jù)集，對所獲取的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，分析SLC19A3基因在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達(dá)情況，及其與預(yù)后的關(guān)系。同時分析Bufalin對乳腺癌細(xì)胞中SLC19A3基因表達(dá)水平的影響，并結(jié)合文獻(xiàn)資料綜合分析。 結(jié)果 對Oncomine數(shù)據(jù)庫中共收集的9項關(guān)于乳腺癌和乳腺正常組織SLC19A3基因有差異表達(dá)的研究數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中SLC19A3基因的表達(dá)明顯高于乳腺正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。通過生存分析發(fā)現(xiàn)低表達(dá)SLC19A3基因的乳腺癌患者無病生存期明顯短于高表達(dá)者，高表達(dá)患者的預(yù)后更好（P < 0.05）。通過挖掘GEO數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集GSE85871發(fā)現(xiàn)Bufalin能夠上調(diào)乳腺癌細(xì)胞SLC19A3基因的表達(dá)（P < 0.01）。 結(jié)論 SLC19A3基因在乳腺癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，并與乳腺癌患者的預(yù)后相關(guān)，該基因可能是Bufalin干預(yù)乳腺癌細(xì)胞的一個新靶點。

[關(guān)鍵詞] 蟾毒靈；乳腺癌；SLC19A3基因；數(shù)據(jù)挖掘

[中圖分類號] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（b）-0012-05

[Abstract] Objective To analyze the expression and its clinical significance of SLC19A3 gene in breast cancer and to explore the effects of Bufalin on the expression of SLC19A3 in breast cancer cells. Methods The datasets about breast cancer and effects of Bufalin on breast cancer cell were retrieved from Oncomine and GEO database， and the datasets were deeply mined and analyzed with literature. SLC19A3 mRNA expression between normal group and breast cancer group as well as correlation with prognosis were analyzed. Meanwhile， the effect of Bufalin on the expression level of SLC19A3 gene in breast cancer cells was also analyzed. Results The expression of SLC19A3 gene in breast cancer tissues was significantly higher than that of breast normal tissues through mining and analyzing the 9 datasets about SLC19A3 gene in breast carcinoma from Oncomine database （P < 0.05）. Survival analysis showed that the disease-free survival of breast cancer patients with higher expression of SLC19A3 gene was significantly better than the patients with lower expression of SLC19A3， and the prognosis of patients with high expression of SLC19A3 gene was better （P < 0.05）. Finally， the mRNA expression of SLC19A3 gene was up-regulated by Bufalin in the datasets of GSE85871 through mining the GEO database （P < 0.01）. Conclusion SLC19A3 gene is under-expressed in breast cancer and its expression level is related to the prognosis of breast cancer， which may be a new target of effects of Bufalin on breast cancer cells.

[Key words] Bufalin； Breast cancer； SLC19A3 gene； Data mining

硫胺素（又稱維生素B1）是維持機(jī)體細(xì)胞能量和代謝所必需的維生素之一。由于其親水性，硫胺素需要載體介導(dǎo)運輸進(jìn)入細(xì)胞，以維持細(xì)胞內(nèi)的硫胺素供應(yīng)。可溶性載體19家族有兩個轉(zhuǎn)運體THTR1（thiamine transporter 1）和THTR2（thiamine transporter 2）負(fù)責(zé)硫胺素的跨膜轉(zhuǎn)運，他們分別由SLC19A2和SLC19A3基因來編碼[1-2]。THTR1和THTR2在機(jī)體內(nèi)廣泛表達(dá)，THTR1高表達(dá)于骨骼肌，負(fù)責(zé)遞送其底物如硫胺素到骨骼肌細(xì)胞，而THTR2高表達(dá)于腸道，介導(dǎo)腸道硫胺素的吸收[3-5]。在低氧應(yīng)激的狀況下，HIF-1α可直接結(jié)合并激活SLC19A3的表達(dá)，從而來調(diào)節(jié)硫氨素的轉(zhuǎn)運來調(diào)節(jié)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[6]。另外，研究表明SLC19A3在急性、慢性缺氧條件下表達(dá)升高[7]。Liu等[8]在MDA231乳腺癌移植瘤鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)SLC19A3表達(dá)下調(diào)。Ng等[9]研究發(fā)現(xiàn)80%（12/15）乳腺癌患者SLC19A3的表達(dá)顯著下調(diào)（P < 0.05）。但是這些研究樣本例數(shù)較少，也比較零散。這些研究提示SLC19A3基因在乳腺癌中可能是一個抑癌基因，改變其被下調(diào)的狀態(tài)將有助于預(yù)后。本研究收集GEO和Oncomine數(shù)據(jù)庫中的公共數(shù)據(jù)集，并對其進(jìn)行挖掘分析，以了解SLC19A3基因在乳腺癌中的表達(dá)和臨床意義。由于中醫(yī)中藥在臨床乳腺癌綜合治療中所起的作用越來越受到重視，在中醫(yī)中藥中尋求治療乳腺癌的方法和藥物不失于一條值得探尋的途徑。在分析過程中，同時發(fā)現(xiàn)蟾毒靈對乳腺癌細(xì)胞SLC19A3基因表達(dá)存在影響，在此一并探討，以期為從中醫(yī)藥中尋找治療乳腺癌的靶點和藥物提供思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)提取

1.1.1 從Oncomine數(shù)據(jù)庫中提取數(shù)據(jù) 登陸Oncomine數(shù)據(jù)庫主頁面https：//www.oncomine.org/，首先進(jìn)行注冊以獲得本數(shù)據(jù)庫的使用權(quán)限，然后根據(jù)如下篩選條件在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行設(shè)定，用來篩選和提取所需要的目標(biāo)數(shù)據(jù)。本研究在數(shù)據(jù)庫檢索界面輸入篩選條件：①cancer type：breast cancer；②gene：SLC19A3；③data type：mRNA或DNA；④analysis type：cancer vs. normal analysis。

1.1.2 從GEO數(shù)據(jù)庫中提取數(shù)據(jù) 在PubMed主界面https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/搜索欄中找到GEO datasets，根據(jù)如下篩選條件在對應(yīng)檢索欄輸入“Bufalin”，“Organism”設(shè)置為“Homo sapiens”來查找符合條件的數(shù)據(jù)集并下載。

1.2 觀察指標(biāo)

比較SLC19A3基因在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達(dá)情況，及其與預(yù)后的關(guān)系。分析Bufalin干預(yù)乳腺癌細(xì)胞后對SLC19A3基因表達(dá)水平的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計學(xué)分析處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行，作圖采用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行，計量資料比較采用t檢驗。采用GEO數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站自帶的GEO2R分析基因表達(dá)譜中的具有差異表達(dá)的基因。采用Kaplan-Meier方法計算SLC19A3表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLC19A3在乳腺癌中的總體表達(dá)情況

利用Oncomine數(shù)據(jù)庫篩選有關(guān)乳腺癌基因差異表達(dá)的研究，設(shè)置相應(yīng)的篩選條件后可見，自2001年起共有9項研究涉及SLC19A3在乳腺癌和正常組織中的表達(dá)，共包括2484例標(biāo)本。文章分別發(fā)表于Nature[10]、TCGA、Proc Natl Acad Sci USA[11]、Breast Cancer Res Treat[12]等國際權(quán)威雜志。Oncomine數(shù)據(jù)庫中對這9項研究結(jié)果數(shù)據(jù)集進(jìn)行二次分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，SLC19A3在乳腺癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1（封四）。

2.2 不同數(shù)據(jù)集中SLC19A3基因在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達(dá)差異

Oncomine數(shù)據(jù)庫中SLC19A3在不同乳腺癌研究數(shù)據(jù)集中的表達(dá)結(jié)果見圖2。研究顯示在Curtis等[10]、TCGA、Radvanyi等[11]、Glück等[12]這9項研究數(shù)據(jù)集中，SLC19A3在乳腺癌中的表達(dá)量均顯著低于正常乳腺組織（P < 0.05）。表1為該9項不同研究中對應(yīng)的SLC19A3低表達(dá)倍數(shù)和對應(yīng)的P值。

2.3 SLC19A3基因與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性

利用上述數(shù)據(jù)庫挖掘的生存信息，采用Kaplan-Meier法分析發(fā)現(xiàn)，SLC19A3基因的表達(dá)水平與乳腺癌患者生存預(yù)后之間存在相關(guān)性，低表達(dá)SLC19A3基因的乳腺癌患者無病生存期明顯差于高表達(dá)患者，高表達(dá)患者的預(yù)后更好（P < 0.05）。見圖3。

2.4 蟾毒靈對乳腺癌細(xì)胞SLC19A3基因表達(dá)的影響

通過分析GEO數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集GSE85871，其中有關(guān)Bufalin作用于乳腺癌MCF7細(xì)胞的基因表達(dá)譜，從中提取探針號為220736_at的SLC19A3基因表達(dá)數(shù)據(jù)，t檢驗分析干預(yù)組和對照組之間的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)Bufalin能夠上調(diào)乳腺癌MCF7細(xì)胞SLC19A3基因的表達(dá)（P < 0.01）。見圖4。

3 討論

目前對SLC19A3基因的研究相對較少，但總結(jié)已有的研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)該基因在腫瘤治療和診斷領(lǐng)域的潛在價值。首先在治療領(lǐng)域，SLC19A3基因作為抑癌基因，能夠影響腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Cheuk等[13]研究發(fā)現(xiàn)促癌因子前列腺素受體2（EP2）能夠下調(diào)SLC19A3表達(dá)，當(dāng)用siRNA下調(diào)EP2表達(dá)或者用EP2受體拮抗劑（AH6809）后，乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力顯著降低，而且伴隨基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2和MMP-9）的表達(dá)降低。如果過表達(dá)SLC19A3基因則細(xì)胞增殖、侵襲能力和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)均降低。可見，SLC19A3基因的表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。其次在診斷領(lǐng)域，SLC19A3啟動子甲基化檢測有望發(fā)展為腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志物。Ikehata等[14]在所研究的四種結(jié)腸癌細(xì)胞中，當(dāng)使用DNA甲基化試劑和/或組蛋白去乙?；噭┖?，SLC19A3基因的mRNA水平顯著下調(diào)。Ng等[9]發(fā)現(xiàn)與非腫瘤組織相比，乳腺癌組織中SLC19A3基因表達(dá)被顯著下調(diào)，而SLC19A3基因啟動子的甲基化率卻顯著升高（P < 0.05）。另外，Liu等[15]發(fā)現(xiàn)胃癌中SLC19A3啟動子甲基化介導(dǎo)了其在胃癌中的表達(dá)被下調(diào)，故推測SLC19A3啟動子甲基化可作為早期胃癌發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物。

本研究為進(jìn)一步探索SLC19A3基因在乳腺癌中的表達(dá)和作用，利用數(shù)據(jù)挖掘的方法分析SLC19A3基因在乳腺癌中的表達(dá)情況，以避免因研究方法、樣本量和人群的差異導(dǎo)致的結(jié)論偏頗。本研究通過深度挖掘Oncomine數(shù)據(jù)庫中收錄的乳腺癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，納入9項研究數(shù)據(jù)集共包括2539例標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLC19A3基因在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。再通過Kaplan-Meier方法分析生存數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，SLC19A3基因低表達(dá)的乳腺癌患者無病生存期明顯短于高表達(dá)者，即高表達(dá)患者的預(yù)后更好。結(jié)合諸多學(xué)者已有的研究結(jié)果可推知SLC19A3在乳腺癌的發(fā)展中起抑癌基因的作用，有望成為乳腺癌治療的新靶點和預(yù)后的新標(biāo)志。

目前中醫(yī)藥在乳腺癌綜合治療中發(fā)揮著不可替代的作用。蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍或黑框蟾蜍的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液，經(jīng)加工干燥而成，性甘辛、溫（也有醫(yī)書提出蟾酥味為辛涼），有毒，能解毒、消腫、強(qiáng)心、止痛，治療瘡、癰疽、發(fā)背等癥[16-17]。研究證實蟾酥抗癌有效成分多為脂溶性化合物，其中蟾毒靈，華蟾毒配基，酯蟾毒配基含量較多，活性較強(qiáng)，具有高效低毒的特點?，F(xiàn)代藥理研究表明其脂溶性成分不僅具有抗腫瘤的作用，同時還能增加機(jī)體對放化療的耐受性，降低化療藥的毒副作用，并降低癌痛發(fā)生率和提高機(jī)體免疫力。本研究中關(guān)注的Bufalin是中藥蟾酥的有效成分。Bufalin可通過抑制AKT的活化、上調(diào)p38的活化與紫杉醇協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18-20]，還可通過抑制順鉑誘導(dǎo)的Met和Src活化，與順鉑協(xié)同抑制MCF-7細(xì)胞增殖[21]。此外，Bufalin可通過下調(diào)cFLIP和XIAP的表達(dá)增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡[22-23]。這些研究均表明Bufalin可能通過多個靶點發(fā)揮抗乳腺癌作用。

本研究發(fā)現(xiàn)Bufalin能夠上調(diào)乳腺癌MCF7細(xì)胞SLC19A3基因的表達(dá)。這個結(jié)果提示SLC19A3基因可能是Bufalin作用于乳腺癌的新靶點，并結(jié)合文獻(xiàn)資料推測可能存在的新抗腫瘤機(jī)制。通過中藥組分的基因表達(dá)譜資料探索藥物的新機(jī)制和新靶點對于中醫(yī)藥研究人員來說是非常方便有效的方法。本研究包含了目前為止最大的樣本量，并且所有數(shù)據(jù)均來自基因芯片，研究方法一致，因此極大地增加了結(jié)論的可信度，將為乳腺癌治療藥物的開發(fā)提供重要的理論依據(jù)和借鑒思路。后續(xù)有待于通過進(jìn)一步的實驗室和臨床研究進(jìn)行驗證。

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